唐天才，劉城成，塔 英，林寶山，陳天祥，曾曉旭，吳毅鵬，宋定州，郝力力*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.阿壩州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 馬爾康 624000；3.四川省若爾蓋縣科學(xué)技術(shù)和農(nóng)業(yè)畜牧局，四川 阿壩州 624500；4.攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院，四川 攀枝花 617061)

【研究意義】寄生蟲病是危害山羊健康的一大類疫病，其中消化道蠕蟲感染的種類最多包括線蟲、吸蟲和絳蟲等，且經(jīng)常表現(xiàn)為混合感染[1]。若未對放牧的山羊驅(qū)蟲，可能會(huì)導(dǎo)致山羊蠕蟲感染率高以及感染強(qiáng)度大，從而影響山羊的生長發(fā)育、生產(chǎn)性能，甚至誘發(fā)其他疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，給山羊養(yǎng)殖帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。【前人研究進(jìn)展】近年來，先后有學(xué)者對國內(nèi)部分地區(qū)的山羊消化道蠕蟲感染情況進(jìn)行了系列調(diào)查，結(jié)果顯示各地區(qū)有著不同的感染程度、感染蟲種以及優(yōu)勢蟲種[1-2]。如陳靜[2]對重慶山羊腸道寄生蟲調(diào)查，檢出5種蠕蟲，總感染率為98.67 %，以圓線蟲為優(yōu)勢蟲種；肖芳萍[1]對貴陽山羊消化道寄生蟲調(diào)查，檢出13種蠕蟲，總感染率為100 %?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，隨著攀枝花養(yǎng)羊業(yè)的不斷發(fā)展，羊存欄數(shù)從2005年的467 430只增加到2010年568 460只，再到2016年702 320只，年均增長率約4 %。隨著攀枝花市山羊一級傳染病預(yù)防工作的深入開展，山羊的烈性傳染病已得到一定程度的控制，而寄生蟲的危害卻日益突出；交易的頻繁，流通領(lǐng)域的擴(kuò)大，同時(shí)也導(dǎo)致了山羊寄生蟲病的擴(kuò)散。自1987年以后就未見系統(tǒng)開展攀枝花山羊寄生蟲病研究的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，迫切需要對山羊消化道寄生蠕蟲的種類開展調(diào)查，以期初步明確種類，為今后該地區(qū)山羊消化道蠕蟲病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 蟲體采集 于2017年12月至2018年12月屠宰攀枝花仁和區(qū)、鹽邊縣以及米易縣的瘦弱山羊或有臨床癥狀的山羊，然后采用蠕蟲學(xué)完全剖檢法檢查：胃、膽囊、十二指腸、盲腸、回腸、空腸、胰腺以及食管，內(nèi)容物用生理鹽水沖洗，再挑出蟲體并置于75 %酒精溶液中，帶回實(shí)驗(yàn)室保存待檢(由攀枝花農(nóng)科院協(xié)助完成)。

1.1.2 主要器材 電泳儀電源(北京六一儀器廠，DYY-6C型)、臺式高速離心機(jī)(eppendorf 5402型)、Leica S9D體視顯微鏡及Bio-Rad梯度PCR擴(kuò)增儀(PTC240型)等。

1.1.3 主要試劑 組織基因組DNA提取試劑盒(EasyPure Genomic DNA Kit)，Trans 2K Plus DNA maker，2×EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金公司)，1×TAE溶液，引物合成、測序均由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(成都公司)完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟲體形態(tài)觀察 根據(jù)《中國畜禽寄生蟲形態(tài)分類圖譜》[3]及《中國草食家畜常見寄生蠕蟲圖鑒》[4]，在體式顯微鏡下觀察蟲體形態(tài)，測量蟲體的大小以及長度，并拍照。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 DNA提?。喝⌒螒B(tài)初步鑒定后的蟲體，放于1.5 mL的EP管，用ddH2O沖洗2～3次，剪蟲體部分置于新的EP管，再按照組織基因組DNA提取試劑盒的步驟逐步提取，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增：線蟲和吸蟲的分子鑒定分別采用Morise[5]和Van[6]報(bào)道的方法，其中線蟲COI基因引物為：COIjb3-F:5′-GATTTTTTGGTCAYCCGCARG T-3′；COIjb5-R:5′-GYAACTACATAATAAGTRTCRT G-3′，400 bp。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。吸蟲18SrRNA基因引物為：18S9 modF: 5′-GATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTG-3′；18S637modR:5′-TACGCTWYTGGAGCTGGAGTTACCG-3′，610 bp。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。2種反應(yīng)均采用25 μl的體系：2×EasyTagPCR SuperMix 12.5 μl、上下游引物各1 μl(10 μmol·L-1)、模板1 μl、ddH2O 9.5 μl混勻，并設(shè)陰性對照(去離子水)。取2 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2 %瓊脂糖凝膠中100V電泳30 min，凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

序列比較分析與進(jìn)化樹構(gòu)建：PCR產(chǎn)物送生工測序，所得序列用DNA Star軟件進(jìn)行拼接，在NCBI中blast進(jìn)行比對，最后應(yīng)用MEGA6.0軟件以Neighbor-Joining法(bootstrap值1000)構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊消化道蠕蟲形態(tài)鑒定以及混合感染情況

本調(diào)查分6次剖檢，共剖24只山羊，從形態(tài)特征以及采集部位初步鑒定攀枝花山羊消化道蠕蟲有6種，其中線蟲5種，分別是羊仰口線蟲(Bunostomumtrigonocephalum，圖1-A)，長19.51～21.90 mm，采自空腸與回腸；粗紋食道口線蟲(Oesophagostomumasperum，圖1-B)，長21.10～23 mm，采自回腸、盲腸以及結(jié)腸；捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus，圖1-C)，長21.00～24.12 mm，采自真胃與小腸；羊毛尾線蟲(Trichurisovis，圖1-D)，長50.50～80.00 mm，采自盲腸；綿羊夏伯特線蟲(Chabertiaovina，圖1-E)，長11.20～12.50 mm，采自結(jié)腸。1種吸蟲為胰闊盤吸蟲(Eurytremapancreaticum，圖1-F)，大小為6.7～7.5 mm×2.8～3.6 mm，采自胰腺?；旌细腥窘y(tǒng)計(jì)顯示：攀枝花山羊消化道蠕蟲混合感染情況嚴(yán)重，混合感染種類多達(dá)5種，2種混合感染主要為胰闊盤吸蟲與不同線蟲的混合感染，3種以上混合感染主要為胰闊盤吸蟲和不同線蟲之間的混合感染(表1)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以提取DNA為模板，分別擴(kuò)增線蟲和吸蟲的目的基因，如圖2所示，在400 和610 bp處均出現(xiàn)特性條帶，大小與預(yù)期相符。

2.3 序列分析

所有序列經(jīng)拼接，兩兩比對，共得8條，其中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的序列3條，其余蟲種的序列均為1條。

表1 山羊消化道蠕蟲混合感染情況Table 1 Polyinfection infection of digestive tract worms in goats

A：羊仰口線蟲；B：粗紋食道口線蟲；C：捻轉(zhuǎn)血矛線蟲；D：羊毛尾線蟲；E：綿羊夏伯特線蟲；F：胰闊盤吸蟲A：Bunostomum trigonocephalum；B：Oesophagostomuma sperum；C：Haemonchus contortus；D：Trichuris ovis；E：Chabertia ovina；F：Eurytrema pancreaticum圖1 山羊消化道蠕蟲的形態(tài)Fig.1 Morphology of worms found in digestive system of goats

線蟲序列BLAST比對后選取同源性最高的序列作為參考序列，構(gòu)建進(jìn)化樹。如圖3所示，各線蟲均聚于各自種類的大支。羊仰口線蟲與云南(JX272232)、吉林(JX272211)、山西(JX27223)分離的羊仰口線蟲(Bunostomumtrigonocephalum)的同源性達(dá)99.46 %～99.73 %。綿羊夏伯特線蟲與分離自陜西的綿羊夏伯特線蟲(Chabertiaovina. KF279336)同源性最高，達(dá)99.46 %。羊毛尾線蟲與分離自湖南的羊毛尾線蟲(Trichurisovis. KY656514)同源性最高，達(dá)100 %。粗紋食道口線蟲與分離自湖南的粗紋食道口線蟲(Oesophagostomumasperum. KM200767)同源性最高，達(dá)99.73 %。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲與美國的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus. AF004935)同源性最高，為93.50 %～94.04 %。吸蟲序列BLAST比對后選取同源性最高的序列以及相近吸蟲的18SrRNA基因序列等作為參考序列，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示本次所得的胰闊盤吸蟲與甘肅的胰闊盤吸蟲(Eurytremapancreaticum. DQ401034)同源性最高，達(dá)99.00 %(圖4)。

3 討 論

長期以來，形態(tài)學(xué)鑒定方法是寄生蟲鑒定的基礎(chǔ)，但此法要求工作人員需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，且對于形態(tài)相近以及未正確保存的蟲體較難準(zhǔn)確鑒定。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，產(chǎn)生的DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)用于物種鑒定具有非常明顯的優(yōu)勢，18SrRNA和COI基因作為DNA條形碼基因之一，已被廣泛的運(yùn)用于吸蟲、線蟲、絳蟲等蠕蟲的鑒定[7-9]。因此，本研究采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對山羊消化道蠕蟲的種類進(jìn)行了鑒定。

M：DL 2000 plus marker；1～5：線蟲樣本；6：吸蟲樣本；7：陰性對照M：DL 2000 plus marker；1-5：Nematodes samples；6：Trematoda samples；7：Negative control圖2 線蟲COI基因和吸蟲18SrRNA基因的PCR反應(yīng)后電泳圖Fig.2 PCR products of COI gene of nemtodes and 18SrRNA gene of trematodes

本研究應(yīng)用PCR對攀枝花山羊線蟲的COI基因序列和吸蟲的18SrRNA基因序列進(jìn)行了分析，值得注意的是，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲各分離株的COI序列差異較大在2.4 %～5.1 %之間，與Genbank中其他捻轉(zhuǎn)血矛線地理株的差異在5.96 %以上。國內(nèi)劉俊琦[10]對永州市羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的COI基因進(jìn)行了分析，其蟲株之間的差異在2.0 %～2.9 %，與Genbank其他捻轉(zhuǎn)血矛線蟲差異在15 %以上；白鵬霞[11]對甘南藏族自治州牦牛的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲COI基因進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該株與其他捻轉(zhuǎn)血矛線蟲地理株的同源性在92.5 %～97.4 %之間；國外Tanveer將巴基斯坦的血矛線蟲與11國家的血矛線蟲分離株進(jìn)行了COI序列的比較與分析，表明血矛線蟲的COI基因流動(dòng)率很高[12]，據(jù)此推測捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的COI基因具有種群遺傳多樣性。另外，本研究也將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的COI序列翻譯為蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了比對與分析，結(jié)果顯示血矛屬線蟲COI序列編碼的蛋白序列完全相同，從氨基酸序列只能鑒定到屬，而不能鑒定到種，與白鵬霞的研究結(jié)果一致[11]。

關(guān)于不同地區(qū)羊消化道蠕蟲種類和分布，國內(nèi)進(jìn)行了相關(guān)調(diào)查，結(jié)果表明諸多因素如地區(qū)、品種、飼養(yǎng)方式等均會(huì)一定程度的影響消化道蠕蟲種類。如黃占欣(2012)等[13]對邯鄲地區(qū)羊消化道蠕蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查，檢出11種蠕蟲，結(jié)果表明集約化養(yǎng)殖與放牧散養(yǎng)羊群消化道蠕蟲的感染種類差異顯著。袁煒(2014)[14]對湖北省公安縣放牧山羊蠕蟲病開展了調(diào)查，檢出10種消化道蠕蟲，表明線蟲一年四季感染情況均嚴(yán)重。本次對攀枝花山羊消化道蠕蟲種類進(jìn)行了初步調(diào)查，結(jié)果顯示山羊消化道感染5種線蟲和1種吸蟲，且存在混合感染，混合感染種類在2～5種之間，其中以混合感染2和3種蠕蟲所占的比例最大(表1)，與國內(nèi)研究報(bào)道基本一致[2,13-14]，表明我國山羊消化道蠕蟲普遍存在混合感染。在四川省，甘孜州和阿壩州放牧牦牛和藏綿羊的肝片吸蟲感染率普遍偏高，然而本次調(diào)查卻未檢出肝片吸蟲，只檢出胰闊盤吸蟲，這可能與兩種吸蟲的生活史以及山羊的放牧地點(diǎn)有關(guān)。肝片吸蟲的中間宿主為椎實(shí)螺(淡水螺的一種)，而胰闊盤吸蟲的中間宿主為陸地螺和中華草螽。本研究中所剖山羊均來自于農(nóng)戶，放牧地點(diǎn)遠(yuǎn)離河流、沼澤等潮濕的環(huán)境，山羊與胰闊盤吸蟲中間宿主—陸地螺接觸的機(jī)會(huì)多，這可能是胰闊盤吸蟲感染嚴(yán)重的主要原因之一，后期可進(jìn)一步開展陸地螺和中華草螽感染胰闊盤吸蟲的調(diào)查。

圖3 基于線粒體COI基因的線蟲的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the COI gene of nematode

圖4 基于核糖體18SrRNA基因的胰闊盤吸蟲及其相關(guān)吸蟲的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the 18SrRNA gene of E.pancreaticum and other related species of trematode

攀枝花屬南亞熱帶亞濕潤氣候，年平均氣溫在19～23 ℃之間，全年無冬，四季不分明，這樣的氣候條件對蠕蟲的繁殖非常有利。因此，后期需要提高農(nóng)戶的驅(qū)蟲意識，加強(qiáng)山羊蠕蟲病的監(jiān)測，開展山羊消化道原蟲和體表寄生蟲種類的全面調(diào)查，從而為該地區(qū)制定合理的驅(qū)蟲方案提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

基于樣本采集部位、形態(tài)特征以及分子生物學(xué)方法，鑒定出攀枝花山羊消化道感染蠕蟲種類多，包括粗紋食道口線蟲、羊仰口線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、羊毛尾線蟲、綿羊夏伯特線蟲以及胰闊盤吸蟲。混合感染嚴(yán)重，需進(jìn)一步加強(qiáng)山羊寄生蟲病的監(jiān)測及防控。