李正風(fēng)，朱 杰，唐 麗，董高峰，吳 濤，廖頭根，張 偉，夏玉珍，王奕權(quán)，李 巖

(1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231；2.紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100；3.北京微普聯(lián)合生物科技有限公司，北京 102200)

【研究意義】纖維素是地球上儲(chǔ)量最豐富的可再生性能源物質(zhì)，全球植物每年新和成纖維素產(chǎn)物達(dá)29億t左右[1]，中國(guó)每年秸稈類(lèi)纖維素產(chǎn)量達(dá)7億t[2]。大量的秸稈被焚燒或丟棄造成資源浪費(fèi)[3]，秸稈類(lèi)物質(zhì)是生態(tài)有機(jī)質(zhì)資源，腐熟還田能增加土壤有機(jī)質(zhì)含量、改善土壤質(zhì)量、減輕長(zhǎng)期施加化肥對(duì)土壤的影響、提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。云南是中國(guó)煙草的主產(chǎn)區(qū)，每年煙葉收獲后產(chǎn)生大量的廢棄秸稈，這些秸稈的隨意堆放及丟棄不僅會(huì)影響環(huán)境而且容易引發(fā)火災(zāi)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究顯示，不同作物的秸稈還田能提高土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性[5]，改良植煙土壤且利于提高煙草品質(zhì)。產(chǎn)纖維素酶菌株的應(yīng)用能提高秸稈類(lèi)物質(zhì)的腐熟效率[6]，縮短發(fā)酵周期，加快秸稈還田效率?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】從云南煙草秸稈自然腐熟物中選擇性分離產(chǎn)纖維素酶菌株，對(duì)菌株進(jìn)行初篩選定部分酶活較高的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，通過(guò)復(fù)篩確定高效菌株，并對(duì)產(chǎn)纖維素酶條件進(jìn)行優(yōu)化。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為促進(jìn)煙草秸稈堆肥還田提供了優(yōu)良種質(zhì)資源，所篩選的高效菌株和優(yōu)化的產(chǎn)酶條件將利于纖維素酶的純酶產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

樣品取自云南曲靖、彌勒煙草秸稈自然堆肥樣品。

1.2 產(chǎn)纖維素酶菌株分離

稱(chēng)取堆肥樣品1 g于10 mL滅菌生理鹽水(0.85 %)中，28 ℃搖床，200 r/min震蕩10 min，分別梯度稀釋10-1～10-8，并分別取100 μl涂布于分離培養(yǎng)基(羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO33 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂15 g、蒸餾水 1000 mL)上。28℃倒置培養(yǎng)5～7 d。分別挑取單菌落至羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基反復(fù)劃線純化，直至純化。并分別保藏至20 %甘油中，-80 ℃冷凍保藏。

1.3 產(chǎn)纖維素酶菌的初篩

將純化后的菌株點(diǎn)接在羧甲基纖維素鈉平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，測(cè)定菌落直徑(D)，在平板上加入剛果紅染液(1 g/L)沒(méi)過(guò)菌落，常溫1 h后棄染液，加入NaCl溶液(0.06 %，w/v)，沖洗3～5次，向平板中加入足量的NaCl溶液1 h，測(cè)定透明圈直徑(H)，計(jì)算H/C值。

1.4 產(chǎn)纖維素細(xì)菌鑒定

將初篩中能形成水解圈的菌株接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15～25 g、蒸餾水 1000 mL，pH 7.4～7.6)中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD=0.8，分別取1 mL菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清，用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒提取總DNA，用Nano Drop OD 2000C檢測(cè)DNA濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別以菌株基因組總DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R[7]擴(kuò)增16S rRNA基因序列，電泳檢測(cè)合格后送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。分別將序列通過(guò)GenBank比對(duì)并選取參考序列，用MEGA 7.0[8]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并根據(jù)系統(tǒng)關(guān)系確定分類(lèi)地位。

1.5 纖維素酶活力測(cè)定

1.5.1 粗酶液制備 分別將待測(cè)菌株接種至15 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(羧甲基纖維素鈉5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO33 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蒸餾水 l 000 mL)中，28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d，6000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.5.2 纖維素酶活力測(cè)定 (1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:配制1.0 mg/mL的葡萄糖溶液作為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液，將母液分別稀釋為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的葡萄糖溶液于5 mL離心管中，分別取2 mL，并分別加入1mL DNS溶液(酒石酸鉀鈉182 g、3,5-二硝基水楊酸6.3 g、NaOH 21 g、苯酚 5 g、亞硫酸鈉5 g、蒸餾水1000 mL)，沸水浴煮沸10 min，冷卻，補(bǔ)加21.5 mL蒸餾水。分別在波長(zhǎng)540 nm用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)菌株纖維素酶活力測(cè)定:濾紙酶活測(cè)定:將新華1號(hào)濾紙剪成1 cm×3 cm的小條，卷成小卷后置5 mL 試管內(nèi)，分別加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH = 4.8) 1.75和0.25 mL酶液，搖勻，使濾紙完全浸泡在液體中，將試管置于50 ℃水浴1 h，加入1 mL DNS試劑，沸水浴10 min后置冷水中冷卻。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，波長(zhǎng)為540 nm。內(nèi)切酶酶活測(cè)定:取含有0.5 %羧甲基纖維素鈉的醋酸緩沖液1.75 mL加入5 mL 試管中，加入酶液0.25 mL，將EP管放入50 ℃水浴0.5 h，加入1 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷水冷卻。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，波長(zhǎng)為540 nm。外切酶酶活測(cè)定:取含有0.5 %微晶纖維素的醋酸緩沖液1.75 mL加入5 mL試管中，加入酶液0.25 mL，于50 ℃水浴2 h后，加入1 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷水冷卻。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，波長(zhǎng)為540 nm。

(3)酶活力計(jì)算:酶活力定義：在50 ℃條件下，1 mL粗酶液在1 min內(nèi)水解底物生成1 μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)纖維素酶酶活力單位(U/mL)[9-11]。

1.6 高效菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.6.1 培養(yǎng)基pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 分別配制pH為4、5、6、7、8、9的羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基，分別接種高效菌株，于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d后測(cè)定纖維素酶活力，確定最佳pH。

1.6.2 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響 配制最佳pH條件，含0.25 %、0.5 %、0.75 %、1.0 %、1.25 %羧甲基纖維素鈉的羧甲基纖維素鈉發(fā)酵培養(yǎng)基，分別接種高效菌株，于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d后測(cè)定纖維素酶活力，確定最佳碳源濃度。

表1 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩結(jié)果Table 1 Primarily screening results for cellulase producing strains

表2 纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of cellulase activity

1.6.3 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響 分別配制最佳pH條件、最佳羧甲基纖維素鈉濃度、含0.25 %、0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %的NaNO3的羧甲基纖維素鈉發(fā)酵培養(yǎng)基，分別接種高效菌株，于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)3 d后測(cè)定纖維素酶活力，確定最佳氮源濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選鑒定

從分離平板上分別挑取不同形態(tài)的細(xì)菌及放線菌，根據(jù)單菌落大小、形態(tài)、顏色最終選定51株菌。經(jīng)剛果紅染色初篩，有15株細(xì)菌形態(tài)菌株、3株放線菌形態(tài)菌株產(chǎn)生透明水解圈。其中9株菌的水解圈最明顯(表1)。透明圈直徑/菌落直徑最大的是菌株L43和zy004，比值達(dá)4.0。雖然透明圈直徑/菌落直徑比值直接反映了酶濃度的高低，但其不能作為菌株酶活的唯一定量指標(biāo)，所以有必要對(duì)這些菌株進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)酶酶活測(cè)定。

2.2 纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建了線性回歸方程。對(duì)在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上有較大水解圈的菌株分別測(cè)定濾紙酶活、內(nèi)切酶酶活、外切酶酶活，結(jié)果如表2所示。其中菌株L43的濾紙酶活最高，達(dá)8.53 U/mL，其外切酶酶活最高，達(dá)20.17 U/mL。綜合初篩和酶活測(cè)定結(jié)果，菌株L43的纖維素酶活力最高。

2.3 產(chǎn)纖維素酶菌株系統(tǒng)發(fā)育地位確定

分別擴(kuò)增并測(cè)定了9株產(chǎn)纖維素酶菌株的16S rRNA基因序列，并分別在GenBank中比對(duì)以獲取同源序列。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)和相似性分析表明，zy001與StenotrophomonaspavaniiLMG 25348T相似性最高99.9 %，命名為Stenotrophomonassp. zy001；zy002與PantoeadispersaDSM 30073T相似性最高99.6 %，命名為Pantoeasp. zy002；zy003與EnterobacterludwigiiEN-119T相似性最高為99.9 %，命名為Enterobactersp. zy003，zy004與NovosphingobiumgossypiiJM-1396T相似性最高為99.6 %，命名為Novosphingobiumsp. zy004，zy005與StreptomycesalbolongusNBRC 13465T相似性最高為99.9 %，命名為Streptomycessp. zy005；zy006與StreptomycesdiastaticusNBRC 15402T相似性最高為99.9 %，命名為Streptomycessp. zy006；zy007與PseudomonastaiwanensisBCRC 17751T相似性最高為98.4 %，命名為Pseudomonassp. zy007；zy008與PseudomonastaiwanensisBCRC 17751T相似性最高為99.9 %，命名為Pseudomonassp. zy008；L43與LuteibacterrhizovicinusLJ96T相似性最高為97.5 %，命名為L(zhǎng)uteibactersp. L43。9株纖維素酶活力較高的菌株屬于7個(gè)屬，其中L43與參考菌株相似性最低，是該屬的一個(gè)潛在新種。

圖1 DNS比色法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose based on DNS colorimetric method

圖2 根據(jù)16S rRNA構(gòu)建的產(chǎn)纖維素酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of cellulase producing bacteria

圖3 pH對(duì)纖維素酶的影響Fig.3 The effect of pH on cellulase

2.4 高效菌株L43發(fā)酵條件優(yōu)化

這9株產(chǎn)纖維素酶較高的菌中，L43酶活最高，所以選擇該菌進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化。如圖3所示，pH對(duì)該菌的纖維素酶活力有一定影響，在pH 6的發(fā)酵培養(yǎng)基中纖維素酶酶活最高。

如圖4所示，在pH 6的發(fā)酵培養(yǎng)基中當(dāng)羧甲基纖維素鈉為1.25 %時(shí)，纖維素酶活力最高。

配制pH 6、羧甲基纖維素鈉為1.25 %的不同氮源(NaNO3)濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基，酶活測(cè)定表明在羧甲基纖維素鈉為0.5 %時(shí)纖維素酶活力最高(圖5)。在發(fā)酵培養(yǎng)基pH 6、羧甲基纖維素鈉濃度為1.25 %、NaNO3濃度為0.5 %時(shí)纖維素酶活力最高，濾紙酶活達(dá)(16.9±1.61)U/mL，外切酶酶活達(dá)(39.62±1.65)U/mL。

圖4 碳源濃度對(duì)L43纖維素酶的影響Fig.4 The effect of carbon source concentration on cellulase

圖5 氮源濃度對(duì)L43纖維素酶的影響Fig.5 The effect of nitrogen source concentration on cellulase

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基從自然發(fā)酵的煙草秸稈堆肥腐熟物中選擇性分離出能產(chǎn)纖維素酶的51株菌，從形態(tài)上分為細(xì)菌及放線菌。經(jīng)過(guò)剛果紅染色初篩，篩選到9株透明圈較大、產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株。經(jīng)16S rRNA序列分析將這些菌為7個(gè)屬。其中纖維素酶活力最高的菌株L43與參考菌株L.rhizovicinusLJ96T相似性較低，為L(zhǎng)uteibacter的潛在新種。通過(guò)單因素試驗(yàn)明確發(fā)酵培養(yǎng)基的pH、碳源濃度、氮源濃度對(duì)纖維素酶活力的影響，并篩選出最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉12.5 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、NaNO35 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蒸餾水 l 000 mL、pH 6。其最高酶活為濾紙酶活：16.9 U/mL，外切酶酶活：39.62 U/mL，培養(yǎng)基優(yōu)化后濾紙酶活提高了，所分離的產(chǎn)纖維素酶活力較高的細(xì)菌及放線菌的外切酶酶活較高，但所有菌株的內(nèi)切酶酶活較低。試驗(yàn)結(jié)果為高效菌株L43的纖維素酶利用提供了理論基礎(chǔ)。

產(chǎn)纖維素酶菌株在自然界中分布廣泛，作為纖維素生物質(zhì)的分解者，在自然界中植物秸稈降解物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮重要的作用，從煙草秸稈中分離出多種產(chǎn)纖維素酶菌株，為煙草秸稈還田提供了優(yōu)良的菌株資源。Stenotrophomonas[12]、Pseudomonas[12-13]、Pantoea[14-15]、Enterobacter[13,16]、Novosphingobium[17]、Streptomyces[13]等屬的菌株有纖維素降解活性，也有相關(guān)報(bào)道。但Luteibacter菌株的報(bào)道并不多，目前該屬有效發(fā)表的種有3個(gè)，其中Luteibacterrhizovicinus分離自大麥根際[18]，從三尖杉根際分離的Luteibactersp.對(duì)三尖杉寧堿具有轉(zhuǎn)化作用[19]，從西沙野生諾尼果成熟果實(shí)中也分離到Luteibacter屬的菌株[20]。因此，Luteibacter屬的菌在自然界與植物會(huì)有一定的互作關(guān)系。有關(guān)Luteibacter菌具產(chǎn)纖維素酶活性是首次報(bào)道，提供了新的產(chǎn)纖維素酶菌株資源。不同微生物有著不同降解效率[21]，多種菌互作能更有效降解纖維素[22]，因此要重視和加強(qiáng)對(duì)多種產(chǎn)纖維素酶菌提高煙草秸稈腐熟的研究。若把混菌發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到煙草秸稈堆肥中，將會(huì)有效提高煙草秸稈的腐熟效率，對(duì)煙草秸稈及其他農(nóng)作物秸稈類(lèi)資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用及環(huán)境保護(hù)具有重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究為煙草秸稈腐熟提供了優(yōu)良產(chǎn)纖維素酶菌株資源，為L(zhǎng)uteibactersp. L43的開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。