喻艷琴，謝姣姣，刁曉艷，張秀秀，王嬋娟，張婷，單可人，何燕*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心血管內(nèi)科，貴州 貴陽 550004)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension,EH)是心血管疾病的重要危險因素之一，有流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，我國EH患病率一直呈增長趨勢；2012年全國成人的EH患病率達(dá)25.2%[1-2]。但EH的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，目前認(rèn)為EH的發(fā)病因素主要包括遺傳、環(huán)境和生活方式等，其中遺傳因素起著重要的作用[3]。關(guān)于EH的分子發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)是亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)，MTHFR基因的C677T(rs1801133)位點(diǎn)是EH的候選基因[4-6]，該基因在不同地區(qū)和不同民族人群的表達(dá)存在一定差異[7]，關(guān)于EH易感基因多態(tài)性與貴州地區(qū)苗族、布依族及漢族人群EH的關(guān)系鮮有報道。本課題組曾報道了內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因rs3918181 多態(tài)性與貴州省苗族、布依族原發(fā)性高血壓的關(guān)系，認(rèn)為該基因的位點(diǎn)多態(tài)性與貴州省苗族、布依族人群EH的發(fā)生可能不相關(guān)[8]。本研究通過探討MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)的多態(tài)性與貴州苗族、布依族及漢族3個民族人群EH的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明EH的分子發(fā)病機(jī)制提供更多的參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象

根據(jù)流行病學(xué)和臨床診斷資料，按照EH組及對照組的標(biāo)準(zhǔn)選取本課題組保存于-40 ℃冰箱中的DNA樣本，苗族、布依族和漢族的DNA樣本分別來源于貴州雷山縣、荔波縣及貴陽的體檢人群，均是3代內(nèi)屬同一民族個體，無異族通婚。EH組：納入標(biāo)準(zhǔn)為2010 年中國高血壓防治指南的標(biāo)準(zhǔn)判斷為EH的患者[收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg]，排除標(biāo)準(zhǔn)為濫用藥物、有精神病史、繼發(fā)性高血壓、心血管疾病、糖尿病及肝腎功能不全等患者、孕婦和哺乳期婦女；標(biāo)本431例，其中雷山苗族137例、男77例、女60例、平均年齡(61.08±13.08)歲，荔波布依族131例、男66例、女65例、平均年齡(59.98±12.45)歲，貴陽漢族163例、男87例、女76例、平均年齡(57.60±10.93)歲。對照組：納入標(biāo)準(zhǔn)為同地區(qū)無高血壓病史及家族史、未服用任何降壓藥、血壓正常的體檢人群，排除標(biāo)準(zhǔn)同EH組；標(biāo)本419例，其中雷山苗族l28例、男44例、女84例、平均年齡(59.64±15.61)歲，荔波布依族131例、男58例、女73例、平均年齡(59.91±15.78)歲，貴陽漢族160例、男72例、女88例、平均年齡(57.08±11.35)歲。所有研究對象均簽署知情同意書，EH組和對照組在年齡及性別構(gòu)成上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1DNA的提取 采血前所有研究對象均禁食12 h，次晨采集空腹外周靜脈血 3 mL，并使用EDTA-K2抗凝，采用酚氯仿法提取外周血DNA。所提取的DNA樣本使用 Thermo ScientificTMNanoDrop Lite 分光光度計(jì)定量后，并標(biāo)化至30 mg/L。

1.2.2基因分型 采用TaqMan-MGB實(shí)時熒光定量PCR法對MTHFR基因的rs1801133位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，實(shí)驗(yàn)儀器為StepOne實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。PCR反應(yīng)為10 μL：30 mg/L DNA溶液1.5 μL，TaqMan genotyping Master MixⅡ 5 μL，rs1801133 探針 0.25 μL，加無菌 ddH2O補(bǔ)足至 10 μL。PCR反應(yīng)條件：60 ℃ 30 s，95 ℃預(yù)變性10 min，后進(jìn)入循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次，最后60 ℃ 30 s，結(jié)束反應(yīng)。采用StepOne Software v2.3 軟件對Real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，完成檢測后從所有樣品中隨機(jī)抽取5%樣本進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果與分型結(jié)果100%相符。

1.2.3測序驗(yàn)證 從不同的基因分型結(jié)果中，隨機(jī)各抽取5個樣本送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗(yàn)證。測序引物：上游5′-TTGGCAGGTTACCCCAAAGG-3′，下游5′-GAACTCAGCGAACTCAGCAC-3′。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1MTHFR基因分型

MTHFR基因rs180113位點(diǎn)的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線見圖1。擴(kuò)增結(jié)果顯示，MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)在3個民族EH組和對照組人群中均存在C和T等位基因，以及CC、CT、TT 3種基因型，見圖2。

圖1 MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 The amplification curve results of MTHFR gene rs1801133 loci by Taqman

注：SNP分型圖，深色圓點(diǎn)為CC野生純合型，淺色圓點(diǎn)為CT雜合型，五星為TT突變純合型，黑色方塊為陰性空白對照。圖2 MTHFR基因rs1801133位點(diǎn) TaqMan 探針實(shí)時熒光定量PCR基因分型Fig.2 The real time fluorescent PCR genotyping results of MTHFR gene rs1801133 loci

2.2測序驗(yàn)證結(jié)果

隨機(jī)從MTHFR基因的rs1801133位點(diǎn)分型結(jié)果中選取5個樣本進(jìn)行測序驗(yàn)證，反向測序結(jié)果與TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR基因分型的結(jié)果完全符合。見圖3。

注：A、B、C分別代表測序結(jié)果為CC野生純合型、CT雜合型和TT突變純合型。圖3 MTHFR基因rs1801133(C/T)位點(diǎn)測序結(jié)果Fig.3 The sequencing results of MTHFR gene rs1801133(C/T) locus

2.3MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性分布

本研究的3個民族群體EH組和對照組基因型頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)均符合Hardy-Weinber平衡(P>0.05)，具有較好的代表性。苗族、漢族及總計(jì)人群EH組與對照組間rs1801133位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；布依族EH組與對照組該位點(diǎn)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性分布的性別差異

結(jié)果顯示，2組被檢者M(jìn)THFR基因rs1801133位點(diǎn)在男女性別間比較，基因型頻率及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.53個民族人群遺傳模式分析

SNPStats在線軟件分析顯示，3個民族人群MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式為隱性遺傳模式，在該模式下CC、CT及TT基因型與EH的發(fā)生無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表1 EH組與對照組MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)基因多態(tài)性比較[n(%)]Tab.1 Comparison of polymorphism distribution of MTHFR gene rs1801133 of the EH group and the control group [n(%)]

2.6布依族人群遺傳模式

SNPStats在線軟件分析顯示，布依族人群MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)的最優(yōu)遺傳模式為隱性遺傳模式，該遺傳模式下TT基因型為危險基因型(OR=5.33，95%CI為1.14～24.82，P<0.05)。見表4。

2.7漢族與苗族、布依族間人群MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性分布的差異

結(jié)果顯示，漢族與苗族、布依族人群MTHFR基因 rs1801133位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

3 討論

EH是心血管疾病中發(fā)病率最高，危害性及致殘性也是最大的。國家衛(wèi)計(jì)委最新發(fā)布的慢性病狀況報告顯示，2012年全國18歲及以上成年人高血壓患病率為25.29%，貴州省18歲及以上成人高血壓患病率已達(dá) 27.8%，高于全國平均水平[10]。貴州是一個多民族聚居的省份，其中苗族、布依族是全省人口數(shù)最多的兩個世居少數(shù)民族。這兩個民族在貴州雷山、荔波等地的地理分布通常相對封閉，人群遺傳背景和生活方式較為單一，因此遺傳同源性比較好，同時當(dāng)?shù)氐纳姝h(huán)境、飲食習(xí)慣以及生活方式等影響血壓的因素較一致，遺傳異質(zhì)性較小。因此本研究選取貴州雷山苗族、荔波布依族人群為研究對象，探討MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性與EH的關(guān)系。

表2 苗族、布依族、漢族中男女間MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)的多態(tài)性分布比較[n(%)]Tab.2 Comparison of polymorphism distribution of MTHFR gene rs1801133 locus between male and female of EH and control groups in Miao and Bouyei and Han[n(%)]

表3 MTHFR基因的rs1801133位點(diǎn)的等位基因、基因型在2組被檢者中的分布Tab.3 The comparison of the allelic and genotype frequencies of MTHFR gene rs1801133 between the both groups

表4 2組布依族人群MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)的等位基因、基因型的分布Tab.4 The comparison of the allelic and genotype frequencies of MTHFR gene rs1801133 locus between the two Bouyei groups

表5 漢族與苗族、布依族間MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)的多態(tài)性分布比較[n(%)]Tab.5 Polymorphism distribution of MTHFR gene rs1801133 comparison between Han and Miao or Bouyei [n(%)]

注：(1)以漢族為對照。

研究顯示，人類MTHFR基因定位于染色體1p36.3，cDNA全長2.2 kb，編碼70 kDa的蛋白質(zhì)[11]。同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高可以造成血管內(nèi)皮損傷和血管平滑肌增生，并抑制一氧化氮合酶和前列環(huán)素(PGI2)的合成，這些損害目前被認(rèn)為與高血壓的發(fā)病有關(guān)[12]。MTHFR基因突變是導(dǎo)致 Hcy水平輕中度改變最常見的遺傳因素，相關(guān)研究表明，MTHFR是血漿中Hcy再甲基化途徑的關(guān)鍵酶，rs1801133基因多態(tài)性可能與其濃度的增高有關(guān)[13-14]，MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)的 C/T 突變使得其編碼的丙氨酸被纈氨酸所取代，并降低其活性和產(chǎn)生熱量，從而成為影響 Hcy 再甲基化的重要代謝途徑[15]。

心血管疾病研究中，EH與MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性關(guān)系的研究一直備受矚目，但結(jié)果卻不盡相同[16-20]。本研究結(jié)果顯示貴州布依族基因型頻率EH組與對照組相比有明顯差異，而貴州苗族、布依族基因型頻率EH組與對照組相比無明顯差異。該結(jié)果提示貴州布依族人群EH的發(fā)病可能與MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性分布相關(guān)，本次貴州布依族人群的研究結(jié)果與河南漢族人群[18]及寧夏銀川漢族人群[21]中發(fā)現(xiàn)EH的發(fā)病可能與MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性相關(guān)的研究結(jié)果一致。

本研究按性別分層后發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因的rs1801133 位點(diǎn)在苗族、布依族、漢族和總民族EH組及對照組男女間基因型頻率及等位基因頻率的差異不明顯。雖然Fang等[22]在數(shù)十年來中國大陸成年人高血壓患病率及特點(diǎn)的系統(tǒng)評價中報導(dǎo)了男性高血壓發(fā)病率較高，但未明確指出MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)的基因型及等位基因在性別上存在差異，提示MTHFR基因rs1801133 位點(diǎn)多態(tài)性可能在男女間不存在差異。

對苗、布依、漢族 3 個民族總?cè)巳汉筒家雷迦巳旱膶φ战M和 EH 組進(jìn)行遺傳模式分析顯示，在最優(yōu)遺傳模式共顯性遺傳模式下，基因型 CC、CT及TT在對照組和EH組中分布頻率的差異不明顯。布依族人群結(jié)果顯示在最優(yōu)遺傳模式隱性遺傳模式下，MTHFR基因的rs1801133 位點(diǎn)TT基因型可能是EH的發(fā)病的危險因素(OR=5.33，95%CI為1.14～24.82，P<0.05)。該研究結(jié)果與Bayramoglu等[23]及吳子瑜等[24]研究中得出的基因型TT可能是原發(fā)性高血壓EH的發(fā)病因素這一結(jié)論相符。

貴州漢族人群分別與苗族、布依族人群MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)苗族、布依族基因型分頻率及等位基因頻率分別與漢族人群的研究結(jié)果相比差異明顯。這些結(jié)果提示，MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率在貴州漢族與苗族、布依族人群中分布存在差異。在三亞市漢族和黎族女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性分布特征[25]及MTHFR基因多態(tài)性在中國人群中的分布及其與疾病的關(guān)系[26]的文獻(xiàn)中報道了MTHFR基因的C677T(rs1801133)在不同民族不同地區(qū)中存在差異，上述報導(dǎo)與本研究結(jié)果一致。說明MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)在不同人群中存在差異，這可能是EH在不同人群中發(fā)病率不同的原因之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)貴州布依族人群EH的發(fā)生可能與MTHFR基因rs1801133位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)聯(lián)，TT基因型可能是危險因素；貴州漢族與苗族、布依族間rs1801133位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布存在差異，但是由于本研究樣本量相對較少，且EH的發(fā)病受環(huán)境、飲食等非遺傳因素的影響，容易產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)偏差，因此還需要大樣本量的研究進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，并從基因方面進(jìn)一步闡述MTHFR基因與EH的關(guān)系。