張潔,毛春燕,劉利利,曾麗娜,劉紅美

(貴州醫(yī)科大學 醫(yī)藥生物技術工程研究中心 &生物與醫(yī)學工程重點實驗室，貴州 貴陽 550025；貴州醫(yī)科大學 生物與工程學院 生物技術教研室，貴州 貴陽 550025)

燈盞細辛[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.]又名燈盞花，菊科飛蓬屬，屬多年生草本植物，主要分布于云南、貴州和四川等省[1]。燈盞細辛亦是貴州民間及少數(shù)民族地區(qū)常用藥材[2]，被收載于2015年版《中國藥典》[3]、《貴州中藥資源》[4]和《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標準》[5]，具有活血通絡止痛、祛風散寒功能，臨床上主要用于缺血性心腦血管病的治療[6-8]，同時還可用于風濕、老年性癡呆、腎衰和糖尿病等疾病的治療[9-11]，因此藥材市場需求量大。由于過度采集挖掘，野生燈盞細辛已逐漸枯竭。植物組織培養(yǎng)技術具有繁殖快、周期短、不受外界因素限制和易管理等優(yōu)勢，是保護野生資源和解決藥材供求矛盾的有效措施[12]。目前，在燈盞細辛組織培養(yǎng)研究方面，學者們對不同外植體誘導效果、愈傷誘導影響因素以及快繁體系建立等方面進行了研究[13-18]，但這些研究報道均為云南產(chǎn)區(qū)燈盞細辛，且在培養(yǎng)基和激素配比的種類、濃度都有所差異，貴州產(chǎn)區(qū)燈盞細辛組織培養(yǎng)快速繁殖的相關研究還未見報道。貴州省亦是燈盞細辛的重要核心產(chǎn)區(qū)之一[1，19]，且燈盞細辛藥材的有效藥用成分含量高，質(zhì)量優(yōu)良[20-23]。因此，本研究通過對貴州產(chǎn)區(qū)的燈盞細辛種子進行無菌播種、獲取無菌苗后，采用不同激素配比的培養(yǎng)基對燈盞細辛離體培養(yǎng)過程中愈傷組織誘導、不定芽形成與增殖、壯苗生根移栽等的影響進行了系統(tǒng)研究，以期為貴州優(yōu)質(zhì)燈盞細辛種苗的快速繁殖提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1種子 從貴州省六盤水地區(qū)野外采集的燈盞細辛種子，由貴州醫(yī)科大學生物技術教研室劉紅美教授鑒定。

1.1.2主要試劑和儀器 配制 Murashige&Skoog (MS)或1/2 MS培養(yǎng)基的化學試劑：瓊脂、6-芐基腺嘌呤(6-benzyladenine，6-BA)、奈乙酸(α-naphthalene acetic acid，NAA)、吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)、甘氨基、肌醇、煙酸、維生素B1、維生素B6及蔗糖均購于北京索萊寶科技有限公司，硝酸銨、硝酸鉀、氯化鈣、硫酸錳、磷酸二氫鉀、硫酸鋅、硼酸、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、乙二胺四乙酸二鈉及硫酸亞鐵均購于天津市致遠化學試劑有限公司；LDZM-60L立式壓力蒸汽滅菌器購自上海申安醫(yī)療器械廠，SW-CJ-1FD 型超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的激素(6-BA、NAA、IBA)，具體濃度及培養(yǎng)基配方見表1，所有培養(yǎng)基添加3%蔗糖和0.9%瓊脂，pH 6.0～6.1，高壓滅菌條件121 ℃、25 min。培養(yǎng)條件為(25±2)℃、光照時間13 h/d，光照強度1 200 lx。

表1 培養(yǎng)基編號和配方Tab.1 Medium number and formulations

注：空格表示沒有加該材料。

1.2.2初代培養(yǎng) 將燈盞花種子用紗布包裹后扎好口，按常規(guī)沖洗干凈后滅菌處理；用75%乙醇浸泡0.5 min，無菌水沖洗2次，3%次氯酸鈉浸泡2 min，無菌水沖洗3次，3%次氯酸鈉浸泡3 min，將種子接種到不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基上進行初代培養(yǎng)以獲取無菌苗。

1.2.3葉片和葉柄愈傷組織的誘導 將獲得的生長健壯的無菌苗葉片切割成0.5 cm×0.5 cm，葉柄切成長1 cm的小段，分別平放接種到添加不同濃度的6-BA和NAA的A1～A9培養(yǎng)基中；每種培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶接種3～5個外植體，重復3次；培養(yǎng)10 d后觀察愈傷組織的誘導生長情況，用“+”表示出現(xiàn)愈傷組織的體積，“+”越多表示愈傷體積越大。

1.2.4不定芽的分化與增殖 將愈傷組織誘導分化的叢生芽切成單株接種于添加不同濃度的6-BA和NAA的A1-A9培養(yǎng)基中，接種要求同1.2.3，培養(yǎng)20 d后對不定芽的分化增殖與生長情況進行觀察統(tǒng)計。

1.2.5生根移栽 將培養(yǎng)后高1.5～2.0 cm的無根小苗轉(zhuǎn)接到添加不同濃度的NAA和IBA的B1～B5培養(yǎng)基中誘導生根，接種要求同1.2.3，待組織培養(yǎng)苗根系生成、并長至合適長度后后進行煉苗移栽，室內(nèi)放置2 d，去封口膜，輕輕洗凈苗根部培養(yǎng)基，移栽到高溫滅菌后的泥土與珍珠巖1 ∶1混合的基質(zhì)中。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1初代培養(yǎng)獲取無菌苗

采用2次3%次氯酸鈉的滅菌方法對種子進行滅菌，污染率為10%；接種6 d左右，種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率可達65%。

2.2葉柄愈傷組織的誘導與分化

葉柄誘導愈傷組織結(jié)果表明A3培養(yǎng)基愈傷誘導時間較短，10～15 d就出現(xiàn)愈傷組織，20 d后愈傷組織的體積較大，且新增芽點多，有利于下一步芽的誘導分化，故選擇A3培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA)為最適宜葉柄愈傷誘導的培養(yǎng)基。見表2。

表2 不同培養(yǎng)基對葉柄愈傷組織誘導的影響Tab.2 Effect of different medium on callus inducement of E.breviscapus petiole

注：+表示出現(xiàn)愈傷組織的體積，越多表示愈傷體積越大。

10 d 20 d圖1 3號培養(yǎng)基中不同時間葉柄愈傷組織誘導Fig.1 The effect of No.3 medium on callus induction

2.3葉片愈傷組織的誘導與分化

葉片接種于培養(yǎng)基后，早期均出現(xiàn)膨大、卷曲，顏色由深綠變成淺綠；培養(yǎng)至第15天時僅A7培養(yǎng)基中葉片上出現(xiàn)較小的突起；培養(yǎng)至第20天時所有培養(yǎng)基中的葉片均逐漸發(fā)黃，A3、A4、A7、A8及A9培養(yǎng)基中出現(xiàn)較為少量的愈傷組織，結(jié)構較為致密；隨著培養(yǎng)時間延長，愈傷組織增殖均不明顯，無芽點出現(xiàn)，愈傷組織和葉片逐漸出現(xiàn)黃化、褐化。因此，葉片不適合作為外植體。

2.4不定芽的增殖

將A3號培養(yǎng)基中葉柄誘導的帶叢生芽的愈傷切成小塊或單株接種到A1～A9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，20 d后不定芽的增殖結(jié)果表明A6培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)相對較高，可達12倍，分化出的不定芽多，且無菌苗的生長狀況也較好，不定芽較粗壯，葉片大，顏色深綠，無玻璃化現(xiàn)象。故 選擇A6培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA)為最佳分化增殖培養(yǎng)基。見表3、圖2。

表3 不同培養(yǎng)基對組培苗增殖的影響Tab.3 The effects on the proliferation of tissue culture seedlings in the different mediums

注：(1)與A1比較，P<0.05；(2)與A2比較，P<0.05；(3)與A3比較，P<0.05；(4)與A4比較，P<0.05；(5)與A5比較，P<0.05；(6)與A6比較，P<0.05；(7)與A7比較，P<0.05。

圖2 6號培養(yǎng)基中增殖的燈盞細辛組培苗Fig.2 Seedlings of E.breviscapus in the sixth medium

2.5生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)20 d無根小苗轉(zhuǎn)接到B1～B5培養(yǎng)基中，10 d后觀察生根情況。結(jié)果表明，燈盞細辛接種在不添加激素的MS培養(yǎng)基中時生根率可達74.44%，但生根數(shù)目較少，根較細長；降低培養(yǎng)基無機鹽濃度，并添加生長素0.3 mg/L NAA和0.3mg/L IBA后生根率提高到89.58%，根生長較為粗壯；當NAA濃度增加到0.5 mg/L和IBA增加至0.8 mg/L時，不僅生根率達到至100%，且生根數(shù)目最多，根粗苗壯，故B5培養(yǎng)基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA)生根效果最佳，為適宜生根的培養(yǎng)基；待燈盞細辛的根生長至3 cm左右時，即可進行煉苗移栽，成活率可在85%以上。見表4。

表4 不同培養(yǎng)基對燈盞細辛無菌苗生根的影響Tab.4 The effects on the rooting of aseptic seedlings in the different mediums

3 討論

為了對保證野外采集種子的滅菌效果，同時增強種子對滅菌劑的耐受性，本研究采用了分開2次2%次氯酸鈉的滅菌方法，滅菌效果較好，污染率低，同時60%的種子能夠萌發(fā)，從而有效建立無菌體系，獲取無菌苗。在植物組織培養(yǎng)快繁體系建立的過程中，激素的種類與配比對于愈傷組織誘導、器官分化、增殖、生根起著關鍵性作用[24]。在愈傷誘導實驗中，本研究中選用了最常用的6-BA和NAA激素，采用不同的濃度配比，對葉柄進行愈傷誘導，結(jié)果表明的細胞分裂素6-BA為1.0 mg/L時，出現(xiàn)愈傷時間較早，體積也較大，其中又以與0.3 mg/L的生長素NAA的搭配效果最好，出現(xiàn)的芽點較多，非常有利于后期的分化增殖和植株再生。故篩選出的最適愈傷誘導培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。另一方面，不同外植體在植物組織培養(yǎng)中誘導愈傷的反應能力是有差異的[25]。實驗中以燈盞細辛的葉片作為外植體時，愈傷誘導反應不佳，并出現(xiàn)褐化、黃化現(xiàn)象，故在該試驗條件下，葉柄比葉片更適合做為誘導愈傷組織的外植體，這與劉成洪等[16]研究結(jié)果一致。

細胞分裂素6-BA對不定芽的增殖和分化有著較強的促進作用，但濃度過高時往往會增加再生芽畸形、玻璃化的概率[26-27]。本實驗中NAA濃度一定時，隨著6-BA濃度的升高，芽的增殖倍數(shù)明顯增高，當6-BA升至3.0 mg/L時，分化的芽增多，增殖倍數(shù)最高可達13倍，但苗較細弱、容易出現(xiàn)玻璃化。因此，6-BA的適宜濃度為2.0 mg/L。同時，適量的生長素配合6-BA使用，不僅能夠促進植株的生長也能提高芽的增殖與分化能力[28]。實驗中6-BA為2.0 mg/L時，搭配0.3 mg/L的NAA，增殖倍數(shù)可達到12倍，無菌苗生長狀態(tài)也良好，故此為分化增殖最適宜的濃度搭配。

生根實驗結(jié)果表明，燈盞細辛組培苗的生根較為容易，在不添加激素的情況下，生根率就可達74.44%，只是根數(shù)目較少，根不夠粗壯，不利于移栽。實驗中，采用降低培養(yǎng)基無機鹽濃度的1/2 MS培養(yǎng)基和添加生長素NAA和IBA，均有利于提高生根率和生根質(zhì)量。隨著NAA和IBA的濃度升高，都能夠使生根率和生根數(shù)目隨之增高，NAA濃度為0.5 mg/L、IBA為0.8 mg/L時，獲得最佳生根效果，這與吳毅歆等[17]采用的激素配比結(jié)果一致。生根效果好的組培苗非常有利于提高后期的煉苗移栽的存活率，同時移栽初期也要注意蓋塑料薄膜保濕，移栽后成活率在85%以上，可用于種植推廣。

綜上所述，本研究建立了適宜于貴州產(chǎn)區(qū)的燈盞細辛的組培快繁體系，從葉柄外植體誘到再生苗移栽大約只需要50～60 d，和常規(guī)人工栽培育苗需要80～90 d的周期相比，大大縮短了育苗周期，有利于快速、高效、低成本的為人工栽培提供大量品質(zhì)優(yōu)良的種苗，對于發(fā)展和推廣貴州燈盞細辛中藥材的規(guī)?；N植具有重要意義。