楊亞平，段素琴，楊鳳梅，李艷艷，劉權(quán)，劉雨，趙遠(yuǎn)，馬紹輝，和占龍

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 &北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118)

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一類由人腸道病毒(human enterovirus,HEV)感染引起的流行性傳染病，多發(fā)生于5歲以下嬰幼兒，可引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和心肺衰竭等癥狀[1-2]，2008年5月HFMD被納入我國(guó)法定報(bào)告的丙類傳染病[3]。近年來(lái)，HFMD引起的病例呈高發(fā)態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重危害嬰幼兒健康和生命安全，給家庭帶來(lái)沉重的疾病和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。目前，我國(guó)對(duì)HFMD的監(jiān)測(cè)主要集中在腸道病毒71型(enterovirus A71,EVA71)、柯薩奇病毒A組16型(coxsackievirus A16,CVA16)、柯薩奇病毒A組10型(coxsackievirus A10,CVA10)和柯薩奇病毒A組6型(coxsackievirus A6,CVA6)，對(duì)其他腸道病毒的分型鑒定尚不多，但近年來(lái)其他腸道病毒比例有所升高[5]；此外，引起HFMD的病原譜構(gòu)成呈多樣化和復(fù)雜化[6]。柯薩奇病毒B組2型(coxsackievirus B2，CVB2)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬B組[7]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，CVB2是引起兒童HFMD的病原體之一[8]，CVB2還會(huì)引起心肌炎和無(wú)菌性腦膜炎[9-10]，嚴(yán)重者可導(dǎo)致多器官感染[11]，尤其是病毒性心肌炎常見(jiàn)的原因[12-13]。目前,對(duì)于病毒性心肌炎的臨床診斷，主要依據(jù)臨床癥狀、生化檢查和心電圖[14-15]，但由于病毒性心肌炎發(fā)病初期癥狀不典型，出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)往往已經(jīng)累及心肌，引起心肌不可逆轉(zhuǎn)的損傷，嚴(yán)重危害健康[16]。由于目前有關(guān)CVB2檢測(cè)方法的報(bào)道甚少，為了加強(qiáng)對(duì)CVB2引起的HFMD的監(jiān)測(cè)及預(yù)防，因此本研究擬建立檢測(cè)CVB2的SYBR Green I逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，為CVB2的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供快捷、有效的分子檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒 CVB2(RW41-2/YN/CHN/2012)、CVA6及CVA10病毒由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室馬紹輝課題組惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑和儀器 JM109感受態(tài)細(xì)胞、pMDTM19-T Vector Cloning 、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、AxyPrep DNA Gel Recovery Kit、in vitro Transcription T7 Kit、One Step TB Green?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit及DNA A-Tailing Kit 均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，TIANpure Midi Plasmid Kit購(gòu)自天根生物有限公司，C1000型 PCR 儀、C1000 TouchTM Thermal Cycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及凝膠成像自動(dòng)分析儀均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成 利用GenBank中CVB2毒株(RW41-2/YN/CHN/2012)的病毒衣殼蛋白1(virus protein 1,VP1)基因序列，通過(guò)MEGA7.0軟件對(duì)本毒株和GenBank中其他CVB2基因序列比對(duì)，之后利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1) ，由上海生工生物工程(股份)公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2制備標(biāo)準(zhǔn)品 用Trizol法提取病毒RNA，采用RT-PCR擴(kuò)增的方法，用PCR引物VP1-F和VP1-R特異性擴(kuò)增875 bp的CVB2 DNA片段；用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit純化PCR產(chǎn)物，利用DNA A-Tailing試劑盒和pMDTM19-T Vector Cloning試劑盒對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端加A與載體連接，形成T-A連接產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，用藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選重組質(zhì)粒，挑取白色菌落轉(zhuǎn)接至含有氨芐的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，切下含有目的片段的3 572 bp瓊脂糖凝膠，用AxyPrep DNA Gel Recovery Kit純化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,體外轉(zhuǎn)錄用In vitro Transcription T7 Kit體外轉(zhuǎn)錄獲得模板RNA。于室溫下采用20 μL體系：10×緩沖液2 μL,腺嘌呤核糖核苷三磷酸(adenine ribonucleoside triphosphate，ATP)、鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷三磷酸(guanine ribonucleoside triphosphate，GTP)、胞嘧啶核糖核苷三磷酸(cytosine ribonucleoside triphosphate，CTP)及尿嘧啶核糖核苷三磷酸(uracil ribonucleoside triphosphate，UTP)各2 μL，T7 RNA Polymerase 0.5 μL，核酸酶抑制劑2 μL，線性化質(zhì)粒50 ng，去離子水補(bǔ)足至20 μL，37 ℃、3 h，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加RNase free DNase I(1 U/L)0.2 L，37 ℃、30 min，用苯酚/氯仿抽提、異丙醇沉淀轉(zhuǎn)錄RNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)[17]。

1.2.3RT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及檢測(cè)方法評(píng)價(jià) (1)優(yōu)化反應(yīng)體系，在相同模板量與反應(yīng)體系中，采用矩陣法優(yōu)化引物濃度，即以無(wú)引物二聚體產(chǎn)生、背景噪音小、熒光信號(hào)強(qiáng)等為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定引物的最佳濃度；(2)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以10倍梯度稀釋CVB2病毒VP1重組質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)品，取濃度102～109拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液8個(gè)梯度，進(jìn)行SYBR Green I RT-PCR反應(yīng)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)特異性檢測(cè)，利用優(yōu)化的SYBR Green I RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)CVB2、CVA6、CVA10、CVA16及EV71的病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)方法的特異性；(4)靈敏性檢測(cè)，將CVB2的標(biāo)準(zhǔn)品按10倍梯度稀釋(100～109拷貝/μL)，使用建立的SYBR Green I RT- PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其對(duì)病毒核酸檢測(cè)的靈敏性；(5)重復(fù)性檢測(cè)，分別制備不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(103、106及109拷貝/μL)，同時(shí)進(jìn)行SYBR Green I RT-PCR，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品做3個(gè)重復(fù)，觀察組內(nèi)重復(fù)性；對(duì)上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別做獨(dú)立的SYBR Green I RT-PCR檢測(cè)，同樣做3個(gè)重復(fù)，觀察組間重復(fù)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1CVB2特異性片段VP1的擴(kuò)增

CVB2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，700～1 000 bp見(jiàn)一條特異性條帶，大小與預(yù)期一致，見(jiàn)圖1A；重組質(zhì)粒pMD19-T-CVB2經(jīng)Xbal酶切后，3 572 bp出現(xiàn)一條清晰的條帶，與預(yù)期相符，見(jiàn)圖1B；用測(cè)定的重組質(zhì)粒序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的CVB2株(RW41-2/YN/CHN/2012)的基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，同源性為99.77%。

注：A為CVB2的VP1片段，B為酶切后的重組質(zhì)粒；M表示DNA marker ，1～3表示3個(gè)重組質(zhì)粒。圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳及重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of RT-PCR products and recombinant plasmids after enzyme

2.2反應(yīng)體系優(yōu)化

經(jīng)矩陣法優(yōu)化后最佳引物終濃度為300 μmol/L，SYBR Green I RT-PCR反應(yīng)體系及各試劑使用量為：2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 10 μL、TaKaRa Ex Taq HS Mix 1.2 μL、PrimeScript PLUS RTase Mix 0.4 μL、RNase free dH2O 5.2 μL、q-RT-PCR-F/R(10 μmol/L)各0.6 μL、模板2 μL。反應(yīng)條件為42 ℃、5 min，95 ℃、10 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40次循環(huán)。

2.3檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

2.3.2特異性評(píng)價(jià) 該方法檢測(cè)CVB2為陽(yáng)性，CVA6、CVA10、CVA16及EV71無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，提示該方法特異性較強(qiáng)，見(jiàn)圖2D。

注：A為擴(kuò)增曲線，B為熔解曲線，C為標(biāo)準(zhǔn)曲線，D為特異性檢測(cè)。圖2 SYBR Green I RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和特異性檢測(cè)Fig.2 Establishment and specific detection of SYBR Green I RT-PCR standard curve

2.3.3靈敏性評(píng)價(jià) 該方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品在102～109拷貝/μL時(shí)，可出現(xiàn)較好的擴(kuò)增曲線，建立的SYBR Green I RT-PCR方法的最低檢測(cè)限為102拷貝/μL。

2.3.4重復(fù)性評(píng)價(jià) 對(duì)不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(103、106及109拷貝/μL)各進(jìn)行3次組間和組內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示組內(nèi)及組間CV均<1%，見(jiàn)表2。

表2 SYBR Green I RT-PCR重復(fù)試驗(yàn)Tab.2 Repeated test results of SYBR Green I RT-PCR

3 討論

近年來(lái)CVB2病毒感染引起手足口病的報(bào)道逐漸增多，建立一種簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)及靈敏性高的檢測(cè)方法對(duì)于手足口病病原的檢測(cè)和分型有重要意義[18]。HFMD相關(guān)病原體的檢測(cè)方法有病毒分離和血清學(xué)診斷，前者是診斷病毒性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測(cè)周期較長(zhǎng)，敏感性較低；后者雖快速，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性的問(wèn)題[19]。目前，HFMD病原體常用檢測(cè)技術(shù)有RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR探針?lè)?、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和基于毛細(xì)管電泳芯片的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)[20-23]。但這些方法需用昂貴的熒光探針或需要引物和復(fù)雜的設(shè)備，而SYBR Green I 染料法不需要熒光探針，并且設(shè)備簡(jiǎn)單[24]。SYBR Green I 染料法中的染料與雙鏈DNA結(jié)合后使熒光增強(qiáng)1 000倍左右，并能對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連續(xù)的檢測(cè)，通過(guò)溶解曲線判斷引物是否有特異性，通過(guò)熔解溫度有效區(qū)分特異性產(chǎn)物、非特異性產(chǎn)物及引物二聚體[25]。同時(shí)，該方法檢測(cè)樣品簡(jiǎn)便快捷，無(wú)需凝膠電泳且可實(shí)時(shí)觀察結(jié)果，大大節(jié)省了時(shí)間[26]。呂莉琨等[27]應(yīng)用該方法對(duì)柯薩奇病毒A組的3個(gè)基因型進(jìn)行了分型鑒定。當(dāng)然SYBR Green I RT-PCR檢測(cè)方法自身也有不足之處：如無(wú)法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，因各實(shí)驗(yàn)室所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品不一致，可能會(huì)使結(jié)果缺乏可比性等，隨著對(duì)檢測(cè)方法的進(jìn)一步優(yōu)化，這些問(wèn)題都將能得到改進(jìn)[28]。

本研究以CVB2的保守基因片段作為RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備的模板，以保證實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在擴(kuò)增合成VP1標(biāo)準(zhǔn)品RNA的DNA模板時(shí)，在用以擴(kuò)增VP1的上游引物的5′端加了T7啟動(dòng)子，之后在體外對(duì)重組質(zhì)粒的VP1片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。該方法從技術(shù)上避免了用載體合成RNA的缺點(diǎn)，同時(shí)利用試劑盒體外轉(zhuǎn)錄的RNA，可以避免交叉污染，減少生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究構(gòu)建的含有T7啟動(dòng)子的CVB2的重組質(zhì)粒，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、精制獲得的RNA用做標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后經(jīng)優(yōu)化后的反應(yīng)體系獲得的熔解曲線單一，曲線平穩(wěn)且無(wú)非特異性溶解峰，可對(duì)CVB2實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增。同時(shí)，利用標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線在102～109拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限度 102拷貝/μL，R2為0.996，擴(kuò)增效率 102.2%；對(duì)EVA7、CVA16、CVA10和CVA6均無(wú)交叉反應(yīng)，組間和組內(nèi)的CV均小于1%。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)CVB2的SYBR Green I RT-PCR方法具有良好的靈敏性、特異性和重復(fù)性，可用于CVB2毒的快速檢測(cè)和定量分析。