徐銀琴，高航，王光義*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 針炙科，貴州 貴陽 550004)

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)新西蘭大白兔24只[SYXK(黔)2018-0001]，雌雄各半，每只體質(zhì)量2.0～2.5 kg，貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要藥品與試劑 通痹方(葛根20 g、桂枝12 g、伸筋草10 g、牛膝10 g、路路通10 g、細(xì)辛10 g、防風(fēng)10 g、川芎15 g、紅花10 g、沒藥20 g、赤芍15 g、獨(dú)活15 g、威靈仙15 g及秦艽15 g)碎成細(xì)末裝進(jìn)布包，為針灸科自制方，中藥材均購自本院中藥房，兔TNF-α試劑盒和兔IL-1β試劑盒購自武漢基因美科技有限公司，蘇木精-伊紅( hematoxylin-eosin，HE )染色液購自湖南艾佳生物有限公司。

1.1.3主要儀器 0.30 mm×25 mm華佗牌無菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品有限公司)、1 730 R高速冷凍離心機(jī)(香港基因有限公司)、YB-6LF生物組織石蠟包埋機(jī)(孝感亞光醫(yī)用技術(shù)有限公司)、YT-6C生物組織攤烤片機(jī)(孝感亞光醫(yī)用技術(shù)有限公司)、AE41光學(xué)顯微鏡(廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司)和ELX800UV酶標(biāo)儀(香港基因有限公司)。

1.2方法

1.2.1造模及分組 選取18只家兔采用無創(chuàng)造模方法建立頸型頸椎病家兔模型[8]：家兔固定于兔固定盒內(nèi)，充分暴露頸部，敷以自制保濕冰袋，使兔的頸部成低頭屈曲位45°，3 h/次、2次/d，周期1個(gè)月；造模成功的家兔隨機(jī)均分為模型組、藥物組和針刺組，每組6只。造模結(jié)束后，模型組不給與任何治療；藥物組是將裝有通痹方藥物的藥包加適量水大火煮沸、小火熬30 min，取出藥包擰去多余藥液，待藥包溫度降至皮膚能耐受時(shí)，敷于家兔頸部，1次/d、15 min/次，治療5次，休息2 d，共治療15次；針刺組是將家兔固定于治療臺(tái)，參照文獻(xiàn)[9]選擇頸夾脊穴行針刺治療，1次/d、治療5次，休息2 d，共治療15次。另取6只正常家兔作為對(duì)照組，不做任何處理。

1.2.2X線觀察頸椎影像學(xué)特征 所有家兔在造模前、造模30 d及治療結(jié)束后進(jìn)行頸椎左側(cè)位X線拍攝，觀察頸椎受累情況。

1.2.3測定痛閾 使用改良后的熱板法[10]：預(yù)先剪去各組家兔頸部毛發(fā)，置于兔盒中直至其安靜并適應(yīng)兔盒內(nèi)環(huán)境后，將預(yù)先加熱至60 ℃的熱鹽水袋直接貼于家兔頸部皮膚上，于每次拍攝X線之前測量和記錄家兔逃避、掙扎及突然轉(zhuǎn)體等逃避反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)的時(shí)間，每隔 20 min測定1次，測3次，取其平均值作為痛閾指標(biāo)。

使用corrcoef函數(shù)時(shí)，兩個(gè)序列的元素個(gè)數(shù)應(yīng)相同。先設(shè)定一個(gè)隨機(jī)數(shù)列，然后用corrcoef(x，y)得出兩數(shù)列的相關(guān)系數(shù)。

1.2.4HE染色法觀察頸椎間盤組織形態(tài) 取出所有家兔C3-4椎間盤浸于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，4 ℃冰箱過夜，0.9%生理鹽水浸洗2～3次，置于10% EDTANa2溶液脫鈣，經(jīng)石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5椎間盤內(nèi)IL-1β和TNF-α 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，取出所有家兔C5-6椎間盤稱重后液氮研磨，按1 g組織加9 mL PBS溶液(0.01 mol/L，pH 7.4)的比例制成組織勻漿，8 000 r/min離心5 min，提取上清液，按照ELISA試劑盒說明書要求操作，于450 nm波長處檢測各孔吸光度，計(jì)算IL-1β和TNF-α濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1頸椎X線

對(duì)照組家兔實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸椎曲度、椎間孔及椎間隙均無明顯改變，未出現(xiàn)骨質(zhì)增生、軟骨及附著韌帶鈣化等情況。與對(duì)照組比較，其余各組家兔頸椎出現(xiàn)不同程度的頸椎生理曲度改變、反弓、椎間隙變窄、椎間孔變小等改變；經(jīng)治療后，針刺組和藥物組家兔頸椎生理曲度較造模后有所改善，部分變窄椎間隙及椎間孔情況較前有所改善，針刺組與藥物組之間無明顯差異。見圖1。

圖1 各組家兔不同時(shí)間的頸椎X線變化Fig.1 Cervical spine X-ray changes of the rabbits at different times of each group

2.2頸部痛閾

造模30 d，模型組、針刺組及藥物組家兔痛閾值分別低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療結(jié)束后，針刺組與藥物組家兔痛閾值分別高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組家兔不同時(shí)間點(diǎn)的痛閾值 Tab.1 Changes of pain threshold in the rabbits of each group at different

注：(1)與對(duì)照組造模30 d相比，P<0.05；(2)與模型組治療結(jié)束后相比，P<0.05。

2.3軟骨終板顯微鏡觀察

對(duì)照組軟骨終板HE染色可見大量圓形或橢圓形正常軟骨細(xì)胞，軟骨囊完整，核染色質(zhì)均勻，軟骨陷窩存在，空泡變性細(xì)胞少見；模型組可見較多空泡變性軟骨細(xì)胞，大部分軟骨陷窩較對(duì)照組增大，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)固縮甚至有少部分出現(xiàn)溶解，膠原纖維排列紊亂，并且部分膠原纖維溶解；針刺組及藥物組軟骨終板組織結(jié)構(gòu)無明顯差別，大部分軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，軟骨陷窩存在，少見細(xì)胞固縮，有少量空泡變性軟骨細(xì)胞，僅有少量膠原纖維排列紊亂、松散，未見膠原纖維溶解。見圖2。

2.4椎間盤組織中TNF-α和IL-1β濃度

與對(duì)照組相比，針刺組和藥物組家兔治療后椎間盤組織勻漿中TNF-α和IL-1β濃度均有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組對(duì)比，針刺組和藥物組家兔治療后椎間盤TNF-α和IL-1β濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與針刺組相比，藥物組家兔治療后椎間盤IL-1β濃度較高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但2組家兔椎間盤TNF-α濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖2 各組家兔軟骨終板組織結(jié)構(gòu)(HE)Fig.2 Tissue structure of cartilage endplate in rabbits of each group(HE)

表2 各組家兔治療后椎間盤組織勻漿中TNF-α與IL-1β水平 Tab.2 The levels of TNF-α and IL-1β in the tissue homogenate of intervertebral disk after treatment in the rabbits of each

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與針刺組比較，P<0.05。

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)常將頸椎病診斷為“項(xiàng)痹”或“痹證”，認(rèn)為頸椎病的發(fā)病與風(fēng)寒濕邪密切相關(guān)，過久的伏案工作致頸部氣血不達(dá)，風(fēng)寒濕邪侵襲，致太陽經(jīng)氣機(jī)不利、經(jīng)脈痹阻，“不通則痛”，則發(fā)為項(xiàng)痹[11]。針灸療法具有疏通經(jīng)絡(luò)、扶正祛邪及調(diào)和陰陽的作用，其療效在國內(nèi)外已經(jīng)得廣泛的認(rèn)可，臨床治療頸椎病常采用的方法有針刺、艾灸及推拿[12-14]等，而選擇中藥外用治療者較少。本實(shí)驗(yàn)所用通痹方熱奄包在課題組臨床已應(yīng)用10余年，主要治療以頸椎病、腰椎病及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等為主的痹癥，在緩解痹癥疼痛、活動(dòng)不利上取得較好療效。本研究以此方為基礎(chǔ)探討中藥熱敷對(duì)頸椎病模型家兔的頸部疼痛情況和頸椎間盤的影響，進(jìn)而探討其治療頸椎病的療效機(jī)制。頸椎病是一種頸椎間盤退行性疾病，多由于頸部長期異常應(yīng)力等因素引起頸椎間盤組織發(fā)生退行性改變[15-16]。其繼發(fā)病理改變包括脊柱節(jié)段不穩(wěn)、骨刺形成、椎管狹窄、椎間盤膨出及椎間盤突出等，若累及到神經(jīng)根、脊髓、椎動(dòng)脈、交感神經(jīng)及脊髓前中央動(dòng)脈等周圍組織結(jié)構(gòu)，可引發(fā)頭暈頭痛、頸肩疼痛及上肢麻木等相應(yīng)癥狀[17-18]。本研究中家兔頸椎X線的結(jié)果顯示，建立模型的家兔頸椎較造模前出現(xiàn)不同程度的生理曲度改變、反弓、椎間隙變窄及椎間孔變小等改變。經(jīng)治療后，針刺組和藥物組家兔頸椎生理曲度較造模后有所改善，部分變窄椎間隙及椎間孔情況較前有所改善，針刺組與藥物組之間無明顯差異。對(duì)家兔頸部痛閾的測量中，造模30 d，模型組、針刺組及藥物組家兔痛閾值均低于對(duì)照組(P<0.05)，治療結(jié)束后針刺組和藥物組家兔痛閾值均分別高于模型組(P<0.05)；軟骨終板HE染色也顯示，模型組軟骨終板退變較為嚴(yán)重，2個(gè)治療組軟骨終板情況相對(duì)較好。提示本研究所采取的針刺及中藥熱敷2種治療方法對(duì)頸椎病均有效，應(yīng)積極予以治療及改善生活習(xí)慣等方式改善頸椎情況。

椎間盤的退變?cè)诜肿訉用娴淖兓饕ㄑ仔砸蜃拥脑黾?、基質(zhì)分解酶含量或活性的增加及髓核細(xì)胞的凋亡[19]。研究表明，炎癥因子通過誘發(fā)炎癥反應(yīng)、刺激細(xì)胞凋亡等途徑加快椎間盤退變進(jìn)程[20-21]，在椎間盤退變進(jìn)程中起到促進(jìn)作用。TNF-α作為重要的炎性相關(guān)細(xì)胞因子參與機(jī)體的免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和炎癥調(diào)節(jié)，通過刺激炎性細(xì)胞聚集和誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[22]。在椎間盤退變的過程中，TNF-α可促進(jìn)椎間盤產(chǎn)生和分泌基質(zhì)金屬降解酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，加快軟骨基質(zhì)的降解，并且抑制軟骨細(xì)胞合成具有透明軟骨特性的蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，促進(jìn)生成有纖維母細(xì)胞特性的I型膠原，致使椎間盤髓核細(xì)胞脫水、彈性減弱、甚至變性死亡，使椎間盤力學(xué)性能受到改變，從而引發(fā)退變[23-24]。

IL-1β可誘導(dǎo)一氧化氮(NO)及MMPs使髓核中的蛋白聚糖分解加劇，同時(shí)其合成受到抑制，致使椎間盤基質(zhì)降解，還可通過影響其他炎性介質(zhì)，間接加劇椎間盤基質(zhì)降解、髓核細(xì)胞凋亡等促進(jìn)椎間盤退變的病理過程[25]。IL-1β本身是一種強(qiáng)有力的致痛物質(zhì)，通過“級(jí)聯(lián)反應(yīng)”式的放大作用刺激某些疼痛介質(zhì)，如NO、IL-6、前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)及磷脂酶A2(phopholipase A2，PLA2)等的合成，使神經(jīng)末梢和背根神經(jīng)節(jié)痛覺敏感性增強(qiáng)[26]。本研究結(jié)果顯示模型組與對(duì)照組相比，家兔治療后椎間盤中TNF-α和L-1β濃度均升高(P<0.05)；與模型組對(duì)比，針刺組和藥物組家兔治療后椎間盤中TNF-α和IL-1β濃度降低(P<0.05)；與針刺組相比，藥物組家兔治療后椎間盤IL-1β濃度較高(P<0.05)，TNF-α濃度無明顯改變(P>0.05)。以上結(jié)果表明家兔頸椎病椎間盤退變過程與TNF-α和IL-1β濃度有關(guān)，且針刺和通痹方熱奄包外敷兩種治療均可降低椎間盤TNF-α和IL-1β濃度。

綜上所述，通痹方熱敷可提升頸椎病家兔頸部痛閾、延緩椎間盤退變，其療效機(jī)制可能與椎間盤中TNF-α和IL-1β濃度降低有關(guān)。