吳國敏，馮玲，楊宇石，史珂蔓，徐澍** ，李珀**

(1.貴州醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院 口腔組織病理學教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院 病理學教研室，貴州 貴陽 550004)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，高居顱內(nèi)腫瘤死亡率的第一位，已被公認是人類的一大健康殺手，膠質(zhì)瘤治療主要是手術(shù)切除加輔助放療和/或化療，然而即使術(shù)后行放化療等綜合治療手段，患者仍然容易出現(xiàn)復發(fā)、耐藥或轉(zhuǎn)移[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因多步驟的過程，腫瘤的復發(fā)惡變可由一條或者多條信號轉(zhuǎn)導通路介導[2-3]。近年來，磷脂酰肌醇3′-激酶信號(phosphatidylinositol 3′-kinase，PI3K)通路成為了研究腫瘤發(fā)病機制的熱點，其在肝癌、肺癌、白血病、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中均有報道[4-8]，然而該通路與人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關系及其機制尚少見報道。因此，本研究采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法(immunohistochemical streptavidin-peroxidase technique，SP)檢測PI3K蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達，同時觀察不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位及分級等不同臨床病理參數(shù)患者的PI3K蛋白的表達差異，以期為研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生機制提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源及分組 收集未經(jīng)化療的膠質(zhì)瘤患者的腦組織腫瘤存檔蠟塊作為實驗組，要求均為首次診斷且有完整的臨床資料(包括性別、年齡、家族史及腫瘤發(fā)生部位等)，確診采取雙盲法按照修訂的第4版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》[9]對膠質(zhì)瘤的分類和分級。實驗組納入膠質(zhì)瘤患者45例，男性23例、女性22例，年齡<40歲29例、≥40歲16例，腫瘤發(fā)生于腦葉者34例、深部者11例，病理分級低級別(Ⅰ～Ⅱ級)30例、高級別(Ⅲ～Ⅳ級)15例；另取25例腦血管病患者的正常腦組織存檔蠟塊作為對照組，男性19例、女性6例，年齡<40歲14例、≥40歲11例。實驗組與對照組患者性別及年齡分布差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2主要試劑和儀器 免抗人單克隆PI3Kp110α抗體、免抗人單克隆PI3Kp110β抗體及免抗人單克隆PI3Kp85抗體(南京沃爾森)，免疫組化超敏反應試劑盒、載玻片、乙二胺四乙酸二鈉修復液(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt antigen retrieval solution，EDTA)、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(3,3-N-diaminobenzidine tertrahydrochloride，DAB)及磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(山東邁新)；AxioLab.A1高清顯微鏡(Carl Zeiss)，HM325輪轉(zhuǎn)式切片機(Thermo)，GeminiAS全自動染色機(Thermo)，ClearVue自動封片機(Thermo)，RHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(中威)，ZYTEST-Ⅰ-40L超純水機(卓越)及101-1AB電熱鼓風恒溫干燥箱(泰斯特)。

1.2方法

1.2.1蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)判斷膠質(zhì)瘤的病理分級 從石蠟包埋的樣本中切取厚度為3μm的組織切片，普通載玻片撈片，65 ℃烤片40 min，二甲苯脫蠟5 min/次、3次，梯度酒精后水化，經(jīng)蘇木精染液染色8 min，水洗，1%鹽酸酒精分化30 s，水洗，碳酸鋰飽和液藍化2 min，水洗，95%酒精脫水后放入伊紅(醇溶性)染色液中染色1 min，95%酒精洗去多余染液；100%酒精脫水2 min/次、2次，二甲苯透明5 min，自動封片機中性樹脂封片。觀察鏡下細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，紅細胞呈橘紅色。

1.2.2PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85蛋白表達 采用SP法檢測，從石蠟包埋的樣本中切取厚度為3 μm的組織切片，65 ℃烤片60 min，三缸二甲苯依次脫蠟各10 min，梯度酒精后水化；采用EDTA高溫煮沸法進行抗原修復，應用3%過氧化氫去除切片的非特異性染色，然后每張切片滴加山羊血清50～100 μL封閉；將現(xiàn)配好的一抗(PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85均按說明書推薦比例稀釋)50～100 μL滴加在切片上，冰箱4 ℃過夜，第2天25 ℃復溫30 min，滴加二抗后置于37 ℃水浴箱孵育1 h，DAB顯色5～10 min，顯色時間以鏡下觀察到棕黃色或棕褐色顆粒為宜；蘇木素復染、分化、返藍、脫水、透明，最后經(jīng)自動封片機用中性樹脂封片觀察。隨機選取10個高倍鏡(400×)視野，計數(shù)其中1 000個細胞，按著色強度無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色分別計為0、1、2及3分；計數(shù)隨機視野內(nèi)細胞核或/和細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒的細胞所占的比例，陰性為0分、≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、≥75%為4分；將染色強度和陽性細胞數(shù)得分乘積>3分判定為陽性表達，≤3分判定為陰性表達[10]。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用頻數(shù)(n)、率(%) 表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1HE染色

實驗組病理分級低級別膠質(zhì)瘤的腫瘤細胞彌漫分布，分化良好，排列疏松，腫瘤細胞呈中等程度增加，異型性不明顯，無核分裂象，無壞死和微血管增生現(xiàn)象；而高級別膠質(zhì)瘤的腫瘤細胞密度明顯增加，異型性明顯，核深染，核分裂象增多，可見怪異的瘤巨細胞，微血管增生，腫瘤浸潤范圍廣，可見出血壞死。對照組腦組織水腫，神經(jīng)細胞變性及減少，局部區(qū)域膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)纖維空泡變。見圖1。

實驗組低級別膠質(zhì)瘤 實驗組高級別膠質(zhì)瘤 對照組腦組織 圖1 實驗組及對照組腦組織HE染色(200×)Fig.1 The brain tissues HE in the experimental group and control group microscopically (200×)

2.2PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85蛋白表達

實驗組及對照組腦組織細胞可見細胞質(zhì)或細胞核中出現(xiàn)不同染色程度的棕黃色或棕褐色顆粒，少部分細胞胞核黃染，見圖2A；實驗組人膠質(zhì)瘤腦組織PI3Kp110α、PI3Kp110β陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但PI3KP85陽性表達率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2B。

2.3實驗組PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85蛋白表達與臨床病理特征的關系

實驗組患者的不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位及病理分級間的PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85陽性表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

3 討論

PI3K信號轉(zhuǎn)導通路即PI3K/蛋白激酶B(protein kinaseB，Akt)/和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號轉(zhuǎn)導通路，又稱PI3K/Akt/mTOR信號通路，主要參與調(diào)節(jié)細胞的生命活動，包括細胞增殖、活化及凋亡，是組織細胞生存及生長的調(diào)控中樞及網(wǎng)絡系統(tǒng)[11]。PI3K家族由3類同工酶組成，其中ⅠA型(class IA PI3K)是研究最為廣泛的一種，由PI3Kp110催化亞基(α，β和δ)和PI3Kp85調(diào)節(jié)亞基組成，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性[12-13]。PI3Kp110α和PI3Kp110β廣泛分布在哺乳動物組織中，PI3Kp110δ與之相反，分布較為局限，主要存在于白細胞[14]；正常情況下，PI3Kp85調(diào)節(jié)亞基抑制PI3Kp110催化亞單位活化PI3K，從而抑制PI3K/Aat/mTOR信號通路的活化[15]；PI3Kp85調(diào)節(jié)亞基是許多細胞胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸激酶受體及磷脂蛋白的作用對象，當細胞胞質(zhì)外相應的配體與此受體相聯(lián)合后,受體被活化，PI3Kp110和PI3Kp85聚合的二聚體產(chǎn)生變化，從而使PI3Kp85對于PI3Kp110的克制作用被解除，PI3K被迅速激活，所以PI3K可以被許多包含酪氨酸激酶受體、非酪氨酸激酶受體及胰島素受體等細胞胞外信號受體所激活[16]；受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)不僅能激活PI3K系統(tǒng)，也能激活Ras激酶系統(tǒng)，進一步來說，Ras激酶亦可結(jié)合PI3Kp110催化亞基并使之同步激活，最后導致PI3K信號轉(zhuǎn)導通路激活[17-18]。通過多年研究，人們已發(fā)現(xiàn)PI3K擁有3個輔酶，可以催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)的3號位羥基被磷酸化，即催化產(chǎn)生磷脂酰肌醇4,5二磷酸[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate,PIP2]及3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇 (phosphatidyl inositol triphosphate，PIP3)[19]。PIP2和PIP3是細胞內(nèi)重要的第二信使，能激活下游一系列蛋白激酶如PKA(protein kinase A)、Akt/PKB(protein kinase B)及PKC(protein kinase C)，從而進一步往下傳輸信號[20]。PI3K信號轉(zhuǎn)導通路對細胞的繁殖、轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運以及凋亡、惡變進程中的多種病理及生理程序起著至關重要的作用[21]。近年來，PI3K/Akt/mTOR信號通路成為研究腫瘤發(fā)病機制的焦點，有報道發(fā)現(xiàn)PI3Kp110α和PI3Kp110β在鼻咽癌、卵巢癌等多種實體腫瘤中出現(xiàn)高表達[22-23]。本研究結(jié)果表明，實驗組PI3Kp110α、PI3Kp110β陽性表達率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與以往的研究結(jié)果一致，因此有理由認為PI3K與膠質(zhì)瘤發(fā)病機制密切相關，PI3K異?；罨笸ㄟ^PI3K信號通路促進了膠質(zhì)瘤的發(fā)生；但實驗組PI3KP85陽性表達率低于對照組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與以往的研究不同[24-25]，還需進一步擴大樣本進行驗證。此外，本研究分析不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位及病理分級患者的膠質(zhì)瘤組織PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85陽性表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與徐余超[26]研究相似，與Sun等[27]結(jié)果部分相似，故可以認為PI3K蛋白陽性表達與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征無關，可能存在其他因素(如復發(fā)、轉(zhuǎn)移等)，從而提示了以后的研究方向。

注：A為SP法檢測各蛋白結(jié)果(箭頭表示陽性表達細胞)，B為各蛋白陽性表達率的條圖；(1)與對照組比較，P<0.05。圖2 實驗組及對照組腦組織中PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85蛋白的表達(SP，×400)Fig.2 Expression of PI3Kp110α，PI3Kp110β and PI3KP85 in brain tissues of the experimental group and the control group (SP，×400)

表1 實驗組PI3Kp110α、PI3Kp110β及PI3KP85的陽性表達與臨床病理特征的關系[(n)%])Tab.1 Relationship between clinicopathological parameters and the expression of PI3Kp110α，PI3Kp110β and PI3KP85 in the experimental group[(n)%]

綜上所述，本研究表明PI3K蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中存在過度表達，但該表達與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征無關。