陳麗，楊帆，趙志紅，秦潔

(天津市環(huán)湖醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，天津 300060)

研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺血缺氧、低灌注是血管性癡呆(vascular dementia，VaD)的最主要的原因。長(zhǎng)期的慢性低灌注改變了腦內(nèi)的微環(huán)境，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)進(jìn)一步確定了小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)與癡呆的新關(guān)聯(lián)[1-3]，提出小膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致腦內(nèi)微環(huán)境功能失調(diào)可能是癡呆病理生理學(xué)基礎(chǔ)。在慢性缺血老化的腦組織中，小膠質(zhì)細(xì)胞可表現(xiàn)出多種表型，在維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著雙重作用[4-5]。小膠質(zhì)細(xì)胞可以極化成M1前炎癥狀態(tài)，釋放前炎癥因子如白細(xì)胞介素6 (interleukin 6，IL-6) 及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)；亦可呈M2抗炎狀態(tài)，通過(guò)IL-4、精氨酸1(arginine-1，Arg-1)、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)緩解炎癥和組織修復(fù)。雷帕霉素(rapamycin)為免疫抑制劑，可通過(guò)抑制mTOR通路達(dá)到控制免疫反應(yīng)的作用，研究表明mTOR可以改變免疫細(xì)胞的活化及分化[6-8]。本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈縮窄(bilateral common carotid artery stenosis,BCAS)法制作VaD 模型，采用雷帕霉素治療，探討雷帕霉素是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)長(zhǎng)期慢性低灌注腦組織中M1/M2的平衡、重建腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，改善認(rèn)知功能，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只成年健康雄性C57BL/6J小鼠，12周齡，體質(zhì)量30～35 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。該研究方案提交醫(yī)學(xué)倫理部門審核，符合相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.1.2主要試劑和耗材 CD16/32一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，Iba1 一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，CD206 一抗購(gòu)自Millipore公司，熒光標(biāo)記抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，抗羊二抗購(gòu)自Invitrogen公司，DAB顯色劑購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，枸櫞酸鹽緩沖液購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，4%多聚甲醛購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，牛血清白蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，10%水合氯醛購(gòu)自天津醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?20只小鼠采用BCAS制作VaD模型，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射將小鼠麻醉，仰臥位，將其固定在解剖手術(shù)臺(tái)上，備皮、消毒；行頸部前正中切口，鈍性分離組織，保護(hù)迷走神經(jīng)，暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈，采用內(nèi)徑為0.18 mm微線圈進(jìn)行BCAS[9]，確認(rèn)無(wú)滲血，縫合切口，并消毒；術(shù)后注意保溫，待動(dòng)物蘇醒后單籠飼養(yǎng)，流質(zhì)飲食，密切觀察。

1.2.2VaD模型的入選標(biāo)準(zhǔn) 考慮到手術(shù)本身對(duì)小鼠的影響，本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)中選用成年健康雄性C57BL/6J小鼠兩測(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行僅穿線不結(jié)扎處理作為假手術(shù)組，對(duì)假手術(shù)組和VaD組存活的小鼠進(jìn)行水迷宮測(cè)試，參考文獻(xiàn)[10]觀察造模情況。結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠平臺(tái)逃避潛伏期在第3天～第5天較VaD組明顯縮短(P<0.05)，提示VaD模型小鼠有認(rèn)知功能障礙，模型制備成功。

1.2.3給藥方法 本研究于建立模型后2周將VaD小鼠隨機(jī)分成VaD組及治療組，每組10只，參考文獻(xiàn)[11]治療組給予2.24 mg/kg的雷帕霉素灌胃，VaD組分別給予與治療組相同體積的PBS灌胃，治療4周。

1.2.4Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 于灌胃4周時(shí)，利用Morris水迷宮檢測(cè)VaD組及治療組小鼠空間記憶能力。(1)定位航行試驗(yàn)：將小鼠于第1象限入點(diǎn)處面向池壁放入水中，記錄小鼠在120 s內(nèi)尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，之后分別從其他3個(gè)象限入水點(diǎn)將鼠放入水中，連續(xù)訓(xùn)練5 d。(2)空間探索試驗(yàn)：于第6天撤去平臺(tái)，在第1象限入點(diǎn)處將小鼠放入水中，記錄小鼠在60 s內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，計(jì)算其在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比及通過(guò)目標(biāo)象限的次數(shù)。

1.2.5組織學(xué)觀察 Morris水迷宮結(jié)束后，麻醉處死小鼠，獲得海馬組織標(biāo)本，常規(guī)固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋，冠狀切片，再脫蠟、水化；蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗2 min，鹽酸乙醇酸化30 s(提插數(shù)下)，自來(lái)水浸泡15 min或溫水(約50 ℃)5 min，置伊紅液染色2 min，常規(guī)脫水，透明，封片，觀察其組織學(xué)改變。

1.2.6腦組織切片Tunnel染色 脫蠟、水化，用0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至95 ℃加熱20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，置于冰丙酮溶液中固定破膜7 min，用PBS洗5 min×3次，滴加Tunnel反應(yīng)混合物50 μL，在濕盒中4 ℃孵育60 min，洗脫，使用DAB顯色套裝進(jìn)行顯色，觀察Tunnel陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7小膠質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志性產(chǎn)物基因表達(dá)水平 采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-qPCR)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞M1表型標(biāo)志性產(chǎn)物基因(CD16、iNOS及TNF-α)及M2表型標(biāo)志性產(chǎn)物基因(IL-10、TGF-β及Arg1)的表達(dá)，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(引物序列見表1)，根據(jù)操作說(shuō)明方法用Trizol提取海馬組織總RNA，然后用定量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)合成cDNA ，用Syber Green 熒光定量 PCR 檢測(cè)，反應(yīng)總體系20 μL，PCR 熱循環(huán)參數(shù)為96 ℃ 4 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，行40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參照基因，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)，將RQ值統(tǒng)計(jì)分析。

表1 RT-PCR目的基因的引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8海馬mTORC1通路相關(guān)蛋白P-Akt和P-p70s6k表達(dá) 采用Western blot法檢測(cè)，稱取海馬標(biāo)本200 mg，按1 mg ∶10 μg的比例加入樣本和蛋白裂解液，用勻漿30 s、共3次，冰上靜置裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，留取上清進(jìn)行蛋白定量；其余上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，用膜封閉液P-p70S6k (1 ∶1 000)、p-Akt (1 ∶1 000及β-actin (1 ∶5 000)一抗，4℃輕搖過(guò)夜。用TBST按照1 ∶5 000稀釋相應(yīng)的二抗，以β-actin作為內(nèi)參照檢測(cè)P-Akt和P-p70 S6k表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，治療組小鼠第3～5天的逃避潛伏期時(shí)間較VaD組顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示雷帕霉素可改善長(zhǎng)期慢性腦缺血引起的認(rèn)知障礙，具有神經(jīng)保護(hù)作用。第6天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組小鼠穿過(guò)目標(biāo)象限時(shí)間及通過(guò)目標(biāo)象限次數(shù)顯著高于VaD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示雷帕霉素對(duì)VaD的認(rèn)知功能具有改善作用。見圖1。

2.2海馬區(qū)HE及Tunnel染色

HE染色結(jié)果顯示，VaD組可見海馬區(qū)細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量減少、細(xì)胞排列紊亂、神經(jīng)細(xì)胞呈缺血樣改變，可見神經(jīng)細(xì)胞壞死、神經(jīng)元外形不易辨認(rèn)，可見核固縮、深染，胞漿內(nèi)容物減少，結(jié)構(gòu)疏松，伴有細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)；治療組細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量基本正常，細(xì)胞排列相對(duì)清晰，僅少量神經(jīng)細(xì)胞可見核固縮、深染，無(wú)明顯的空泡樣改變；提示雷帕霉素能夠改善長(zhǎng)期慢性腦缺血引起的腦組織病理變化，對(duì)VaD有保護(hù)作用(圖2A)。Tunnel結(jié)果顯示，治療組Tunnel陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較VaD組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B-C)，提示雷帕霉素能夠明顯減少海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，可能是改善VaD小鼠的認(rèn)知障礙的機(jī)制。

注：(1)與VaD組比較，P<0.05。圖1 2組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The effect of rapamycin on behaviors of mice in two groups

注：A為HE染色，B為Tunnel染色，C為Tunnel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);(1)與VaD組比較，P<0.01。圖2 2組小鼠海馬CA1區(qū)HE染色及Tunnel染色結(jié)果(200×)Fig.2 The effect of rapamycin on cellular structure and apoptosis in CA1 area of mice in two groups(200×)

2.3小膠質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志性產(chǎn)物基因表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與VaD組比較，治療組小鼠海馬組織M1表型標(biāo)志性產(chǎn)物基因(CD16、iNOS及TNF-α)表達(dá)顯著降低，M2表型標(biāo)志性產(chǎn)物基因(IL-10、TGF-β及Arg1)表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示雷帕霉素抑制了海馬組織的前炎癥反應(yīng)，促使海馬區(qū)炎癥因子內(nèi)環(huán)境由M1向M2轉(zhuǎn)變。見圖3。

2.4mTORC1通路相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與VaD組比較，治療組小鼠海馬區(qū)P-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著升高、P-p70s6k蛋白表達(dá)水平顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示雷帕霉素抑制P-p70s6k的表達(dá)，同時(shí)反饋性地降低了對(duì)P-Akt的抑制。見圖4。

3 討論

本研究從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)3個(gè)不同角度，驗(yàn)證了雷帕霉素通過(guò)減輕微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2的平衡對(duì)腦缺血損傷長(zhǎng)期慢性低灌注導(dǎo)致VaD起保護(hù)作用。為了研究認(rèn)知功能，本研究采用水迷宮試驗(yàn)對(duì)VaD組及治療組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能明顯改善VaD小鼠的認(rèn)知功能。研究報(bào)道，BCAS能導(dǎo)致小鼠顱內(nèi)三分之一的血流量減少[12]，尤其是海馬CA1區(qū)[13]，于是本研究通過(guò)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠改善長(zhǎng)期慢性腦缺血引起的腦組織的病理變化，進(jìn)一步通過(guò)Tunnel染色發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠明顯減少海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而改善VaD小鼠的認(rèn)知障礙。VaD疾病的病理過(guò)程極為復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，其中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化在認(rèn)知障礙的發(fā)病機(jī)制中起著越來(lái)越重要的作用[5,14]。小膠質(zhì)細(xì)胞M1代表促炎狀態(tài)，誘導(dǎo)組織內(nèi)神經(jīng)元損傷擴(kuò)大；相反，M2 具有較強(qiáng)的吞噬和清除壞死或凋亡神經(jīng)元碎片的能力，以避免繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織再生[15-16]。于是實(shí)驗(yàn)采用CD16、iNOS及TNF-α作為M1標(biāo)記，用IL-10、TGF-β及Arg1作為M2標(biāo)記進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組M1炎癥標(biāo)記物產(chǎn)物基因相對(duì)表達(dá)量較VaD組顯著下調(diào)，M2炎癥標(biāo)記物產(chǎn)物基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，提示雷帕霉素抑制了海馬組織的前炎癥反應(yīng)，促使海馬區(qū)炎癥因子內(nèi)環(huán)境由M1向M2轉(zhuǎn)變。小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血應(yīng)激的極化分型對(duì)減輕VaD的炎癥反應(yīng)及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)起著重要的作用，適當(dāng)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2的平衡對(duì)腦缺血損傷的預(yù)后具有保護(hù)作用。大量研究表明mTOR通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移和存活中起著核心地位，對(duì)生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及機(jī)體能量狀態(tài)等產(chǎn)生應(yīng)答,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、自噬、代謝及調(diào)控細(xì)胞周期等[17]，此外，mTOR還具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化、活性和功能的作用[18-19]，抑制mTOR通路可以調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2的極化狀態(tài)，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[7]。雷帕霉素作為mTOR的抑制劑，可以延長(zhǎng)壽命，減緩許多與衰老相關(guān)的疾病，比如阿爾茨海默病、帕金森病及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病等[20-22]。本研究證實(shí)了雷帕霉素對(duì)VaD的發(fā)病及進(jìn)展也具有一定的延緩作用。值得注意的是，有研究表明通過(guò)抑制mTORC1可以降低Akt，從而選擇性抑制IRE1α/JNK/NF-κB途徑，有效降低炎癥反應(yīng)[23-25]，本研究進(jìn)一步印證了mTORC1-Akt這一反饋環(huán)路，雷帕霉素通過(guò)抑制mTOR信號(hào)通路從而降低下游產(chǎn)物P-p70S6K的表達(dá)，P-p70S6K的減少又反饋性促進(jìn)p-Akt的激活，從而抑制的炎癥，使M1向M2轉(zhuǎn)化。

注：與VaD組比較，(1)P<0.05，(2) P<0.01。圖3 2組小鼠海馬區(qū)M1/M2表型標(biāo)志性基因表達(dá)Fig.3 The effect of rapamycin on the mRNA expression levels of M1 and M2 markers of mice in two groups

注：與VAD組比較，(1)P<0.05，(2) P<0.01。圖4 2組小鼠海馬區(qū)mTORC1通路蛋白表達(dá)Fig.4 The effect of rapamycin on P-Akt and P-p70S6k expression of mice in two groups

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期慢性缺血缺氧狀態(tài)下所致的VaD小鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，打破了M1/M2平衡，導(dǎo)致大量神經(jīng)元壞死，從而降低了小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，雷帕霉素通過(guò)抑制mTORC1通路調(diào)節(jié)M1/M2穩(wěn)態(tài)，從而有效減輕慢性腦灌注不足引起的認(rèn)知功能障礙，這為VaD的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。