綦廷娜，石暢，汪政勇，宗永麗，李金福*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第968醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)分泌科，遼寧 錦州 121000；3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 寄生蟲學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

弓形蟲是一種廣泛寄生于人和動(dòng)物有核細(xì)胞內(nèi)的原蟲，能引起人獸共患弓形蟲病，嚴(yán)重威脅人類健康和影響畜牧業(yè)發(fā)展[1]。人類感染弓形蟲后絕大多數(shù)無明顯臨床癥狀，但孕婦及免疫功能低下者(如艾滋病或惡性腫瘤、器官移植等長期接受化療或免疫抑制劑治療的病人)感染弓形蟲后則引起嚴(yán)重的危害[2]，然而迄今為止尚無理想的弓形蟲病治療藥物[3]。鑒于應(yīng)用疫苗可以預(yù)防許多疾病的經(jīng)驗(yàn)和宿主感染弓形蟲后可獲得一定的抗感染免疫力，因此研制能應(yīng)用于臨床且安全有效的弓形蟲病預(yù)防接種疫苗成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[4]。近年研究表明，弓形蟲表面抗原1(surface antigen 1，SAG1)和致密顆?？乖?(dense granule antigen 1，GRA1)蛋白是極具潛力的弓形蟲疫苗候選抗原[5-8]，且采用單一SAG1或GRA1蛋白作為疫苗抗原的免疫效果不如SAG1或GRA1與其他弓形蟲抗原聯(lián)合所產(chǎn)生的免疫效果理想[9-10]。目前尚未見SAG1與GRA1的聯(lián)合抗原成分是否能產(chǎn)生更好的免疫效果的報(bào)道。因此，本研究擬構(gòu)建SAG1-GRA1復(fù)合基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1，并觀察其在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)情況，為后續(xù)疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料、主要試劑與儀器

1.1.1材料與主要試劑 弓形蟲RH株、質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)、大腸桿菌DH5α及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、EcoR Ⅰ、XhoⅠ、T4DNA連接酶及Premix Taq均購自寶生物工程(大連)有限公司，E.Z.N.A.Gel Extraction Kit購自廣州鉑爾公司，兔抗弓形蟲血清多抗由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自行制備，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的羊抗兔抗體購自北京成文免疫化學(xué)研究室，轉(zhuǎn)染試劑Keygen TransⅢ購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博大泰克公司，高糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)、小牛血清及胰蛋白酶購自美國Gibco公司。

1.1.2主要儀器 5331型基因擴(kuò)增儀(德國Eppendorf公司)、IQuant400凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司)、MCO-17AI恒溫CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)、TE2000-U熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)、Avanti J-251冷凍高速離心機(jī)(美國BECKMAN公司)及MDF-U2086S超低溫冰箱(日本三洋公司)。

1.2方法

1.2.1蟲體基因組DNA的提取 無菌吸取感染弓形蟲RH株小鼠的腹腔液2 mL，4 ℃、2 000 r/min離心10 min，棄上清，采用酚-氯仿抽提法提取含蟲沉淀物的基因組DNA。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 基于GenBank收錄的弓形蟲RH株SAG1和GRA1基因序列(登錄號X14080.1和HM067753.1)，分別去除終止密碼子或起始密碼子后設(shè)計(jì)2對5′端添加限制性內(nèi)切酶識別序列的PCR引物。見表1。

1.2.3SAG1基因(不含終止子)和GRA1基因(不含起始子)的擴(kuò)增 以提取的弓形蟲RH株基因組DNA為模板，在合成的引物參與下，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min的PCR反應(yīng)程序分別擴(kuò)增SAG1和GRA1基因；擴(kuò)增SAG1和GRA1基因的同時(shí)，另以蒸餾水為模板，分別以SAG1和GRA1基因的引物為引物，設(shè)置陰性對照1和陰性對照2進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，以DNA Marker為參照，1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.2.4SAG1基因(不含終止子)和GRA1基因(不含起始子)的克隆 分別將質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)與SAG1基因(不含終止子)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、EcoR Ⅰ雙酶切，或質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)與GRA1基因(不含起始子)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切。利用T4DNA連接酶16 ℃過夜條件下，將膠回收純化后的酶切產(chǎn)物SAG1基因(不含終止子)、GRA1基因(不含起始子)片段分別與酶切后的相應(yīng)質(zhì)粒載體pcDNA3.1(+)相連接。熱激休克法將連接反應(yīng)液分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并將所得菌液均勻涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平皿上，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h。

表1 SAG1和GRA1的引物序列及目的片段大小Tab.1 Primers used in this study

1.2.5含SAG1基因(不含終止子)或GRA1基因(不含起始子)陽性重組質(zhì)粒的酶切篩選鑒定及序列測定 隨機(jī)挑取上述LB培養(yǎng)基平皿上的數(shù)個(gè)菌落，分別進(jìn)行小量搖菌培養(yǎng)。用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液中的質(zhì)粒DNA，分別進(jìn)行KpnⅠ、EcoR Ⅰ或EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切，并以DNA Marker為參照，1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。采用雙脫氧鏈終止法對酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.2.6含SAG1-GRA1復(fù)合基因重組質(zhì)粒的克隆、酶切篩選鑒定及序列測定 利用引物P3、P4對測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GRA1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲得的GRA1基因(不含起始子)產(chǎn)物和測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1分別進(jìn)行EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切。參考1.2.4和1.2.5，將膠回收純化后的酶切產(chǎn)物GRA1基因(不含起始子)片段與酶切后的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)和KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，以及酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1的測序。

1.2.7pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)分為pcDNA3.1(+)對照組和pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶對生長狀態(tài)良好的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行消化，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以5×105個(gè)/孔接種于事先放有厚玻璃蓋片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長至70%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，PBS 100 μL中分別加入質(zhì)粒DNA 5 μg，混勻后加入Keygen TransⅢ轉(zhuǎn)染試劑10 μL，混勻、室溫放置15 min，輕微振搖培養(yǎng)板將混合液逐滴加入接種有細(xì)胞的培養(yǎng)板中置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.8免疫熒光法檢測目的基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，從培養(yǎng)板中取出細(xì)胞爬片，PBS清洗，40 g/L多聚甲醛固定，2%Triton X-100處理，PBS清洗、封閉血清，加1 ∶200兔抗弓形蟲血清多抗20 μL，4 ℃過夜，PBS清洗后加1 ∶100 FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，37 ℃孵育15 min，PBS清洗后封片，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1SAG1、GRA1基因的PCR擴(kuò)增

從弓形蟲RH株的基因組DNA中擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致，約1 010 bp的SAG1基因片段、570 bp的GRA1基因片段(圖1)。

注：M為DNA 標(biāo)志物，1～4分別為SAG1基因、GRA1基因、陰性對照1及陰性對照2。圖1 SAG1及GRA1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 PCR products of SAG1 and GRA1 gene

2.2重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1、pcDNA3.1(+)-GRA1及pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1的酶切鑒定

質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1經(jīng)KpnⅠ、EcoR Ⅰ雙酶切后，可見與空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)等大、與SAG1基因片段長度相當(dāng)?shù)碾娪緱l帶；質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-GRA1經(jīng)EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切后，可見與空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)等大、與GRA1基因片段長度相當(dāng)?shù)碾娪緱l帶；質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1經(jīng)KpnⅠ、EcoR Ⅰ雙酶切后獲得1條空質(zhì)粒加GRA1片段長度之和約6 000 bp，另1條與SAG1片段長度相符的電泳條帶。經(jīng)EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切后獲得1條空質(zhì)粒加SAG1片段長度之和約6 400 bp，另1條與GRA1片段長度相符的電泳條帶。經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切后獲得1條空質(zhì)粒片段長度，另1條與SAG1加GRA1片段長度之和相當(dāng)約1 600 bp的電泳條帶，見圖2。

注：M1、M2分別為 DNA標(biāo)志物1和2，1、6分別為 Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切的pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1，2、4分別為 Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ雙酶切的pcDNA3.1(+)-SAG1和pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1，3、5分別為 EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切的pcDNA3.1(+)-GRA1和pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1。圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid

2.3SAG1基因(不含終止子)、GRA1基因(不含起始子)及SAG1-GRA1復(fù)合基因序列測定

酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1、pcDNA3.1(+)-GRA1、pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1經(jīng)測序，所導(dǎo)入的基因片段長度分別為1 008 bp(不含終止子)、570 bp(不含起始子)及1 578 bp，所得序列與GenBank中收錄的SAG1基因、GRA1基因序列對比后同源性為100%，確屬弓形蟲RH株SAG1基因、GRA1基因及SAG1-GRA1復(fù)合基因。

2.4免疫熒光法檢測SAG1-GRA1融合蛋白的表達(dá)

熒光顯微鏡下可見，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)均有較強(qiáng)的綠色熒光，普光下可見同一視野中的細(xì)胞形態(tài)清晰，表明pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1已成功轉(zhuǎn)入NIH3T3細(xì)胞，并在其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的NIH3T3細(xì)胞在熒光顯微鏡下未見綠色熒光。見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1在NIH3T3細(xì)胞中SAG1-GRA1融合蛋白的表達(dá)(200×)Fig.3 Immunofluorescence assay for the protein expression in NIH3T3 cells transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1 (200×)

3 討論

抵御感染性疾病最行之有效的方法之一就是免疫預(yù)防[11]。目前常采用基因工程表達(dá)的蛋白或蛋白亞單位，或者編碼這些蛋白的基因作為免疫預(yù)防的免疫原分子[11]。在病原體眾多的抗原成分中選擇何種蛋白或其編碼的基因作為免疫抗原分子是關(guān)鍵[2]。目前，用于弓形蟲感染免疫預(yù)防的免疫原或其編碼基因的篩選主要集中在SAG基因(包括SAG1、SAG2及SAG3等，該抗原主要位于弓形蟲速殖子的表面，能誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，很容易成為免疫應(yīng)答攻擊靶點(diǎn))、GRA基因(已知有GRA1、GRA2及GRA3等，該抗原參與了弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的寄生和發(fā)育過程，也具有較強(qiáng)的免疫原性)及棒狀體蛋白(rhoptryprotein，ROP)基因(已知有ROP1、ROP2、ROP3等)等候選抗原基因上[12]。這些候選抗原基因可以被單獨(dú)[13-15]或聯(lián)合[16-20]用于構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒，進(jìn)而用作抗弓形蟲感染核酸疫苗。以上研究結(jié)果顯示，含這些候選基因的單基因或復(fù)合基因的重組質(zhì)粒免疫實(shí)驗(yàn)小鼠后表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫原性，使小鼠抗感染能力增強(qiáng)，且含復(fù)合基因的重組質(zhì)粒具有更好的免疫效果[9-10]。

目前國際公認(rèn)具有較強(qiáng)免疫原性和免疫保護(hù)性的弓形蟲疫苗候選抗原是SAG1和GRA1蛋白，其編碼基因SAG1和GRA1則是有效的弓形蟲核酸疫苗候選基因[7-8]。這可能是因?yàn)椋篠AG1蛋白為速殖子主要的膜抗原之一，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原以及毒力蛋白[6]；GRA1蛋白可誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生以IFN-γ升高為特征的保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答，血清中可檢測到特異性IgG，并對弓形蟲RH株的攻擊感染具有一定的保護(hù)性[8]。因此，本研究選用弓形蟲SAG1和GRA1蛋白編碼基因作為疫苗候選基因，先構(gòu)建真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1和pcDNA3.1(+)-GRA1。為增強(qiáng)免疫效果，聯(lián)合2抗原基因，在含SAG1和GRA1單基因重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1，并觀察其在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)。對3種重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶雙酶切及DNA測序分析結(jié)果顯示，插入pcDNA3.1(+)的片段分別為1 008 bp、570 bp和1 578 bp，與預(yù)期的SAG1、GRA1和SAG1-GRA1復(fù)合基因分子大小相當(dāng)、序列一致，說明所構(gòu)建的真核表達(dá)重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定正確，為其進(jìn)入真核細(xì)胞后表達(dá)正確的目的基因編碼蛋白提供了保證。免疫熒光染色法結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)觀察到較強(qiáng)的綠色熒光，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)未見綠色熒光，說明重組質(zhì)粒所含的SAG1-GRA1基因在真核細(xì)胞NIH3T3內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生了目的基因編碼蛋白，并具有免疫原性，最終可被免疫熒光染色檢測。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，SAG1-GRA1復(fù)合基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-SAG1-GRA1構(gòu)建成功，SAG1-GRA1基因可在被轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞中有效表達(dá)，為弓形蟲SAG1-GRA1復(fù)合基因疫苗的研究提供了研究基礎(chǔ)。