Nganguem Nzalle Yranney Brice，林慕之，毛善永，張蓓，周海燕，胡柏龍，王藝明，況春燕，劉興德,6***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心血管內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科,貴州 貴陽(yáng) 550002；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 超聲科，貴州 貴陽(yáng) 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 麻醉科，貴州 貴陽(yáng) 550004；5.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心理科，貴州 貴陽(yáng) 550004；6.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550025)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPC)是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，雖然其在外周血液循環(huán)中所占比例較小，但能促進(jìn)缺血性組織的血管修復(fù)和新生[1]。前期研究表明，骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在缺血性疾病的治療中起到關(guān)鍵作用，例如在急性心肌梗死[2-3]、不穩(wěn)定心絞痛[4-5]、中風(fēng)[6]、糖尿病微血管病[7]、肺動(dòng)脈高壓[8]及動(dòng)脈粥樣硬化[3，9]等疾病中。因此，研究EPC的生長(zhǎng)、遷移及其他生物學(xué)特性，可為缺血性疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。文獻(xiàn)從骨髓[10-11]、心臟血[12]、或胎鼠肺[13-14]中均可提取EPCs，本課題組建立從SD大鼠骨髓中獲取單個(gè)核細(xì)胞，分離、培養(yǎng)并鑒定EPCs的方法，該方法穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)且有效避免細(xì)胞污染，為今后探索EPCs的生物學(xué)特性奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

SD大鼠購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)，雄性，約8周齡，體質(zhì)量(150±20) g。DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自四季青公司，CD34-PE抗體購(gòu)自Abcam公司，CD133-DyLight 488抗體購(gòu)自Novus公司，VEGFR2-FITC抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1EPCs的分離 SD大鼠麻醉后用頸椎脫臼法處死，將大鼠固定于操作臺(tái)上，酒精常規(guī)消毒3次；取下并分離大鼠雙側(cè)股骨及脛骨，用含10%胎牛血清的PBS沖洗3遍；兩端剪除少許骨骺端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器抽取大鼠臟器組織淋巴細(xì)胞分離液試劑盒中的勻漿沖洗液沖洗大鼠股骨及脛骨骨髓腔，獲得含骨髓細(xì)胞的沖洗液置于50 mL離心管中，將沖洗液用200目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞懸液；3 000 r/min，離心10 min，棄上清，用樣本稀釋液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105～1×106個(gè)/L，取15 mL離心管，加入6 mL大鼠臟器組織淋巴細(xì)胞分離液，并將獲得的骨髓細(xì)胞懸液緩慢加入離心管中；2 000 r/min，離心30 min，離心完畢可以觀察到3層細(xì)胞，底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層，中層為白膜層、此層為單個(gè)核細(xì)胞層，最頂層為血漿層。用吸管輕輕吸取中層細(xì)胞。

1.2.2EPCs的培養(yǎng) 將分離細(xì)胞以3×102個(gè)/L密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，48 h后更換20%新鮮完全培養(yǎng)基(DMEM低糖培養(yǎng)基含20%胎牛血清，青霉素105U/L，鏈霉素100 mg/L)，去除未貼壁的細(xì)胞，每5 d換液1次。

1.2.3EPCs的鑒定及檢測(cè) 收集培養(yǎng)7 d的EPCs，用0.25%胰蛋白酶消化，置于流式上樣管中，將消化所得細(xì)胞用PBS 1 000 r/min離心5 min清洗3次，棄上清；用PBS 100 μL重懸細(xì)胞，每管加入LCD34-PE 2 μL和CD133-DyLight 488抗體2 μL，另取一管加入VEGFR2-FITC 2 μL，4 ℃避光孵育30 min、用PBS洗滌離心、使用PBS 400 μL重懸細(xì)胞，避光保存待上機(jī)檢測(cè)。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1EPCs細(xì)胞觀察 倒置顯微鏡下觀察大鼠骨髓來源EPCs細(xì)胞培養(yǎng)在48 h、1周及2周時(shí)的形態(tài)學(xué)變化，采用流式細(xì)胞儀鑒定EPCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD133及VEGFR2的表達(dá)。

1.3.2生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 分別消化并收集培養(yǎng)2、4、5、7、8、10、14及18 d的EPCs，在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，每次取3個(gè)孔細(xì)胞，計(jì)算平均值，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1EPCs細(xì)胞形態(tài)

EPCs細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，大部分懸浮的細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)，可見細(xì)胞呈多邊形、梭形、多角形；培養(yǎng)1周細(xì)胞逐漸變大、細(xì)胞數(shù)增多，呈鋪路石樣；培養(yǎng)2周的大部分細(xì)胞可見明顯增多，可見克隆樣集落。見圖1。

培養(yǎng)48 h 培養(yǎng)1周 培養(yǎng)2周圖1 大鼠骨髓來源EPCs形態(tài)學(xué)觀察(40×)Fig.1 The morphology of EPCs isolated from rat bone marrow(40×)

2.2流式細(xì)胞儀鑒定EPCs

EPCs培養(yǎng)7 d時(shí)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)共表達(dá)CD34-PE和CD133-DyLight 488細(xì)胞比例(圖2A)。結(jié)果顯示，CD34+和CD133+雙陽(yáng)性細(xì)胞占總體(22.15±1.002)%、CD34+單陽(yáng)性細(xì)胞占(21.32±1.044)%及CD133+單陽(yáng)性細(xì)胞占(28.67±0.711)%；VEGFR2+細(xì)胞數(shù)量(17.91±1.418)%，較未經(jīng)染色對(duì)照組(1.52±0.129)%顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B、C、D)。結(jié)果提示，該細(xì)胞為EPCs。

注：(1)與Unstain組比較，P<0.05。圖2 流式細(xì)胞儀鑒定EPCs細(xì)胞中CD34、CD133及VEGFR2的表達(dá)Fig.2 The expression levels of CD34,CD133 and VEGFR2 on EPCs by flow cytometry

2.3EPCs的生長(zhǎng)曲線

血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果提示，細(xì)胞生長(zhǎng)的潛伏期在第1～4天；第5～9天時(shí)，EPCs增殖迅速，進(jìn)入指數(shù)增生期；第10～13天時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期；第14天以后，細(xì)胞逐漸進(jìn)入衰亡期。見圖3。

圖3 EPCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of EPCs

3 討論

自1997年Asahara等[15]首先發(fā)現(xiàn)骨髓來源的EPCs細(xì)胞后，EPC在心血管健康中的重要作用日益被人們所認(rèn)識(shí)。成熟內(nèi)皮細(xì)胞的再生能力有限，因此，研究者對(duì)循環(huán)的內(nèi)皮祖細(xì)胞日益重視，特別是對(duì)其可維持內(nèi)皮完整性、功能及產(chǎn)后新生血管的作用[16]。研究表明，EPCs不僅可恢復(fù)損傷后的內(nèi)皮功能，而且還可參與血管生成，為新的治療帶來希望[17-18]。越來越多的證據(jù)表明，在心血管疾病的情況下，EPCs功能會(huì)下降和受損[19-20]。因此，目前在臨床中應(yīng)用EPCs對(duì)缺血性心臟病進(jìn)行治療成為研究熱點(diǎn)。隨著研究深入，各課題組分別從骨髓、心臟及胎鼠肺等提取EPCs。研究證實(shí)，骨髓中EPCs是外周血的15倍[21]，因此，從骨髓中提取EPCs是一種高效的方法。本課題組分離大鼠雙側(cè)股骨及脛骨，可獲得約4×107左右細(xì)胞，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。此外，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)約8周齡SD大鼠適合提取EPCs，周齡過大或者過小對(duì)于骨髓來源的EPCs的數(shù)量提取都會(huì)產(chǎn)生較大影響。

現(xiàn)有一系列不同的方法鑒定EPCs，傳統(tǒng)上EPCs被定義為表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(VEGFR2)和標(biāo)記祖細(xì)胞標(biāo)志物(CD34/CD133)的細(xì)胞，然而圍繞這個(gè)定義有相當(dāng)多的爭(zhēng)論，因?yàn)檫@些標(biāo)記都不是完全特異性的[22-23]。相關(guān)研究報(bào)道，CD34+、CD133+及VEGFR2+細(xì)胞是造血性細(xì)胞，實(shí)際上可能不是真正的EPCs[24]。隨著研究深入，目前研究表明，EPCs細(xì)胞表面的標(biāo)志物并不是固定的，而是一個(gè)動(dòng)態(tài)演變的過程，隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞演變的過程中，其干性逐漸丟失[25]，干細(xì)胞的標(biāo)志物CD133也逐漸降低直至丟失，但確定為內(nèi)皮祖細(xì)胞至少能表達(dá)干細(xì)胞特征CD133、CD34或者內(nèi)皮細(xì)胞的特征VEGFR2[26-27]。Schemidtlucke等[28]研究也闡明將流式細(xì)胞儀鑒定CD34和VEGFR2雙陽(yáng)性且CD45弱陽(yáng)性的細(xì)胞定義為EPCs。根據(jù)本課題組研究表明，課題組選用CD34、CD133及VEGFR2表達(dá)陽(yáng)性的鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞，結(jié)果提示所培養(yǎng)的細(xì)胞確實(shí)為EPCs細(xì)胞。

綜上所述，本課題組建立了一系列從大鼠骨髓細(xì)胞中分離，培養(yǎng)及鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法，該方法便捷、高效、經(jīng)濟(jì)，為進(jìn)一步探索EPCs細(xì)胞的分化、增殖、遷移及其他生物學(xué)特性奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。