Nganguem Nzalle Yranney Brice，毛善永，莫麗莉，林慕之，張蓓，周海燕，王藝明，況春燕，劉興德,5***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心血管內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科,貴州 貴陽(yáng) 550002；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 超聲科，貴州 貴陽(yáng) 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 心理科，貴州 貴陽(yáng) 550004；5.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550025)

Schlafen(Slfn)基因家族是可以調(diào)控T淋巴細(xì)胞活化及胸腺成熟的一系列重要基因[1-2]。目前Slfn基因家族包括10種鼠源基因，成員蛋白都有一個(gè)“Slfn盒”，“Slfn盒”與其臨近的ATP/GTP可結(jié)合至AAA結(jié)構(gòu)域上，根據(jù)蛋白質(zhì)的長(zhǎng)短，該家族蛋白可以分為3個(gè)不同亞類[3-4]。Slfn3屬于中等長(zhǎng)度蛋白，其蛋白亞型有一個(gè)由5個(gè)氨基酸(Ser-Trp-Ala-Asp-Leu)組成的高度保守 “SWADL”序列[5]。研究表明Slfn家族蛋白可以作用于Cyclin D1抑制細(xì)胞的增殖、分化及衰老等[6-7]，但仍有部分功能尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Slfn1可抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和遷移[8]，但是對(duì)于Slfn3的生物行為學(xué)調(diào)控尚未闡明，為了探討Slfn3對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)影響，本研究擬構(gòu)建攜帶Slfn3基因的重組腺病毒載體pAdeno-EF1-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，并在HEK293細(xì)胞中完成包裝及擴(kuò)增，獲得重組腺病毒rAD-Slfn3，為其在內(nèi)皮祖細(xì)胞中研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 高保真的PrimeSTAR酶、TaKaRaMiniBEST割膠回收試劑盒、pAdeno-EF1a-MCS-MCMV-EGFP-3FLAG載體、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、無(wú)縫克隆試劑盒、T4 DNA連接酶、DH5α感受態(tài)細(xì)胞及限制性內(nèi)切酶NheI及測(cè)序引物均由華大基因公司提供或合成，并負(fù)責(zé)進(jìn)行陽(yáng)性克隆的測(cè)序。

1.1.2儀器 DNA電泳槽、穩(wěn)壓電泳儀及凝膠成像儀購(gòu)自Bio-rad公司，PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司，冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的構(gòu)建 以GeneBank中已經(jīng)收錄的大鼠Slfn3基因(Genebank ID：XM_017597672.1)的cDNA為模板，用VectorNTI軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并對(duì)該片段進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，并把目的基因條帶從電泳后的瓊脂糖凝膠中切割下來(lái)，經(jīng)過(guò)膠回收后將目的基因片段和線性化載體反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a；挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切鑒定，酶切鑒定正確序列送華大基金進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序正確后命名為pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，示意圖見圖1A，測(cè)序引物序列為Slfn3-F CTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTT，Slfn3-R CCTCGACTGTGCCTTCTA。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與腺病毒包裝 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用Admax系統(tǒng)，將穿梭質(zhì)粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG與腺病毒輔助質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中獲得重組腺病毒rAD-Slfn3。

1.2.3病毒擴(kuò)增 將HEK293細(xì)胞鋪在10 cm皿中，待細(xì)胞匯合達(dá)到90%以上，加入合適滴度病毒感染細(xì)胞，5～6 d后，細(xì)胞全部病變，收獲細(xì)胞將其反復(fù)凍融3次，收獲病毒并將其分裝。

1.2.4病毒滴度測(cè)定 取5.0×105個(gè)HEK293細(xì)胞接種于24孔板，常規(guī)培養(yǎng)，將稀釋的病毒液加入24孔板中，感染48 h后，傾去培養(yǎng)液，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計(jì)病毒感染細(xì)胞效率，顯微鏡下數(shù)熒光陽(yáng)性的細(xì)胞集落，選擇5個(gè)視野，在10×的物鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每孔平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和病毒滴度。病毒滴度(PFU/mL)=(每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)×每個(gè)視野細(xì)胞的個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù))/0.1 mL。

1.2.5Western blot分析 因穿梭質(zhì)粒上帶有Flag標(biāo)簽，rAD-Slfn3感染HEK293細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并將其裂解，提取蛋白樣本，用Western blot鑒定HEK293細(xì)胞是否表達(dá)Flag蛋白。

2 結(jié)果

2.1穿梭質(zhì)粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的構(gòu)建

將割膠回收得到的Slfn3通過(guò)線性化載體pAdeno-EF1a-MCS-MCMV-EGFP-3FLAG反應(yīng)，挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)Slfn3成功插入目標(biāo)載體中(圖1B)。測(cè)序分析(圖1C)顯示pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG包含Genebank公布的Slfn3基因序列，表明pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG構(gòu)建成功。

注：A為穿梭質(zhì)粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的示意圖，B為PCR電泳結(jié)果，C為測(cè)序結(jié)果。圖1 穿梭質(zhì)粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAGFig.1 The map,digestion pattern and Slfn3 sequencesofpAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG

2.2病毒包裝

選取測(cè)序正確的pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染11 d后可見細(xì)胞大量漂浮，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞呈綠色(見圖2)，收集細(xì)胞并獲得重組腺病毒rAD-Slfn3。

熒光顯微鏡 普通光鏡圖2 轉(zhuǎn)染后11 d鏡下HEK293細(xì)胞形態(tài)(40×)Fig.2 GFP expression in HEK293 cellsunder fluorescence microscope and optical microscope on 11th days after transfection(40×)

2.3轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞Flag標(biāo)簽的表達(dá)

檢測(cè)轉(zhuǎn)染穿梭質(zhì)粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293細(xì)胞可以表達(dá)Flag標(biāo)簽，目的基因Slfn3的預(yù)測(cè)蛋白大小約為67 kDa，其大小與預(yù)測(cè)一致，而對(duì)照組無(wú)Flag蛋白表達(dá)(見圖3)。

注：1為Marker，2為HEK293細(xì)胞，3為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，4為轉(zhuǎn)染穿梭質(zhì)粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG的HEK293細(xì)胞。圖3 Flag標(biāo)簽的檢測(cè)(Western blot)Fig.3 Flag expression in HEK293 cells transfected with or without pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG(Western blot)

3 討論

Slfn家族成員在細(xì)胞增殖、分化及其調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等方面都有重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)Slfn1、1L、2、3、4、5、8、9、10及14在鼠中表達(dá)[10-14]；Slfn5、Slfn11、Slfn12，Slfn13及Slfn14在人體內(nèi)表達(dá)[15-18]。Slfn家族成員在T細(xì)胞激活，胸腺成熟等生物學(xué)過(guò)程中起重要作用。Slfn3最初在鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)，其在心臟和胸腺中的表達(dá)量較低[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞激活時(shí)，Slfn3的表達(dá)明顯增加[20-21]。同時(shí)，Slfn3也可在CD4+CD25+的循環(huán)T細(xì)胞中表達(dá)，這意味著Slfn3在調(diào)控T細(xì)胞分化等免疫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用[22]。此外，研究發(fā)現(xiàn)Slfn3可通過(guò)增加p27的表達(dá)，抑制CDK2的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖[20]。但是，Slfn3是否可以調(diào)控心血管系統(tǒng)，對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及其遷移的影響及機(jī)制迄今為止尚未研究。本研究構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pAdeno-EF1a-Slfn3-MCMV-EGFP-3FLAG，并將該質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得重組腺病毒rAD-Slfn3，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，并通過(guò)Western Blot鑒定其表達(dá)該質(zhì)粒，為后續(xù)探索其對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和遷移奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

構(gòu)建腺病毒的方法主要有Adeno-X系統(tǒng)、Adeasy系統(tǒng)及其AdMax系統(tǒng)[23]。Adeno-X系統(tǒng)是采用體外直接連接的方法，效率較低，因酶切位點(diǎn)有限，限制了該方法的應(yīng)用[24-25]。Adeasy系統(tǒng)及其AdMax系統(tǒng)都是運(yùn)用同源重組的研究原理，Adeasy系統(tǒng)是利用在細(xì)菌體內(nèi)同源重組的原理[26-27]，AdMax系統(tǒng)利用了HEK293細(xì)胞內(nèi)同源重組的原理，利用Cre/loxP重組酶將攜帶外源基因的穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中重組，產(chǎn)生腺病毒[28]，本研究利用AdMax系統(tǒng)獲得重組腺病毒rAD-Slfn3，該系統(tǒng)具有效率高、產(chǎn)率高及操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，本研究通過(guò)菌落PCR和測(cè)序證實(shí)該穿梭質(zhì)粒序列正確后，將其與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裝后鑒定，重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞中Flag標(biāo)簽的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Flag標(biāo)簽在病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)，確定獲得重組腺病毒rAD-Slfn3。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了大鼠Slfn3基因rAD-Slfn3重組腺病毒載體，為研究該基因?qū)π难芟到y(tǒng)的調(diào)控及其對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及其遷移的影響奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。