呂菊，胡玉梅，任真奎,3，謝鵬，張春林，焦玲，禹文峰**

(1.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗科，貴州 興義 562400；4.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025；5.貴州醫(yī)科大學附院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550004)

帕金森病(parkinson disease,PD)的病理特征是中樞和外周特定神經(jīng)元群的神經(jīng)退行性病變和殘存的多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)的嗜酸性小體-路易小體(lewy body，LB)，主要發(fā)生在黑質(zhì)致密部[1]。PD的發(fā)病機制主要是紋狀體DA的缺失使患者控制肌肉的能力受到限制；紋狀體DA含量的降低使膽堿能系統(tǒng)的功能發(fā)生障礙，這是產(chǎn)生PD各種運動癥狀的生化基礎[2]。PD目前仍是臨床難以治愈的神經(jīng)退行性疾病，DA替代治療只能在最初給藥時緩解病人癥狀[3]，因此尋找新的PD機制是可能根治疾病的方法。2001年，Magre等[4]首次在人類患者11號染色體上發(fā)現(xiàn)一種名為Berardinelli-Seip先天性脂肪代謝障礙2型(berardinelli-seip congenital lipodystrophy 2，BSCL2/Seipin)新基因的突變，該基因的突變起初被認為與脂肪代謝障礙有關。BSCL2基因編碼的Seipin蛋白是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白，該蛋白在脂肪組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達[5-6]，因此Seipin的功能研究也主要集中在這兩種組織病變中。近年研究發(fā)現(xiàn)Seipin基因突變與多種運動神經(jīng)元疾病存在一些聯(lián)系，如腦內(nèi)Seipin的功能異常與運動性神經(jīng)病和Silver綜合征有關，小鼠神經(jīng)元丟失Seipin會導致焦慮和抑郁等[7-11]。這些研究結(jié)果提示Seipin異?？赡苁菍е露喾N神經(jīng)退行性疾病的重要因素。目前已有研究表明，Seipin突變能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激蛋白CHOP的增加、進而誘發(fā)細胞凋亡的發(fā)生[12]。因此，本實驗主要研究對大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma cells 12，PC12)細胞中Seipin基因進行干擾，觀察Seipin缺陷后引起的細胞生物學變化，為進一步研究帕金森疾病中神經(jīng)元的凋亡機制提供新的方向。

1 材料與方法

1.1材料、主要試劑及儀器

1.1.1材料 PC12細胞(中國科學院上海細胞庫)，Seipin shRNA慢病毒、陰性對照慢病毒及慢病毒載體GV248(上海吉凱基因生物公司),RNAi靶序列為ACGCTCGGTGATGCTTCATTA，陰性對照靶序列為TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.1.2主要試劑與儀器 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，0.25%Trypsin-EDTA(美國Thermo Fisher公司)，Penicillin Streptomycin雙抗(美國Life Technologies公司)，Protease Inhibitor Cocktail、Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail、裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)(美國CST公司)，兔多克隆抗體BSCL2/Seipin(美國Abcam公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、中性樹脂、Hochest凋亡染色試劑及TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(中國碧云天生物科技公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，曝光儀(美國Gene公司)。

1.2方法

1.2.1PC12細胞的培養(yǎng)與種板 PC12細胞使用含有10%胎牛血清和雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基于5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度到達70%～80%時，棄舊培養(yǎng)液，無菌PBS緩沖液加入漂洗，吸去PBS緩沖液；0.3 mL胰酶消化細胞加入培養(yǎng)基終止消化，巴氏吸管吹打貼壁細胞，將所有的液體轉(zhuǎn)入新的無菌15 mL Epp管中，1 000 r/min離心5 min，棄液，加入3 mL培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)；制備30個/L細胞懸液3 mL，取100 μL/孔加入96孔板用于慢病毒預感染實驗，取500 μL/孔加入48孔板用于慢病毒正式感染。

1.2.2慢病毒預感染實驗 為了確定PC12細胞合適的感染復數(shù)(multiple of infection，MOI)及是否需要助感染試劑，按照不同培養(yǎng)條件將實驗分為空白感染組(未加助感染劑)及助感染組(加助感染試劑HitansG)，用不同MOI值的病毒感染細胞；DMEM培養(yǎng)基將shRNA慢病毒顆粒依次稀釋成病毒滴度為1×105TU/L(MOI=100)，1×104TU/L (MOI=10)及1×103TU/L (MOI=1)，待細胞生長至20%～30%，換掉舊培養(yǎng)基，加入培養(yǎng)基100 μL/組，對應病毒滴度的慢病毒試劑90 μL和助感染試劑10 μL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)；感染細胞10 h時吸走培養(yǎng)基，加入正常DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；細胞感染48～72 h，熒光顯微鏡觀察病毒感染的熒光強度，當熒光強度達80%、且細胞生長正常組所對應的感染條件和MOI值即為PC12細胞合適的最佳感染條件，記錄此時接種的細胞量、感染時的總體積、感染后換液的時間及細胞的MOI值。

1.2.3Seipin蛋白表達水平 采用Western blot檢測，依據(jù)上述獲得的感染條件，用陰性對照病毒和Seipin-shRNA目的病毒感染PC12細胞，分別作為陰性對照組與Seipin敲低組，同時設置正常組(正常PC12細胞)；待細胞密度90%時用已配好的裂解液提取細胞總蛋白，與適量5×Buffer混勻，沸水煮沸變性蛋白，12% SDS-PAGE凝膠電泳(40 mA)，用PVDF膜作為轉(zhuǎn)膜濾紙冰浴轉(zhuǎn)膜，200 mA、2 h；5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌2次、5 min/次；膜用一抗孵育過夜，TBST洗滌3次、5 min/次；對應二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次、10 min/次；曝光儀獲取圖像，并用Image J計算蛋白條帶灰度值。

1.2.4細胞凋亡 采用TUNEL和Hoechst染色試劑盒檢測，將陰性對照組與Seipin敲低組細胞種于12孔板，待細胞密度達到60%～70%時，用預冷的PBS洗滌細胞2次，5 min/次；4%多聚甲醛固定細胞20 min，含0.3%Triton X-100的PBS室溫孵育5 min，PBS洗滌細胞3次，分別用于TUNEL和Hoechst染色。前者系加入配好的TUNEL檢測液37 ℃孵育60 min，PBS洗滌細胞，DAPI封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞染上紅光的情況；后者系加入0.5 mL Hoechst 33258染色液染色5 min，PBS洗滌細胞，中性樹脂封片，鏡下觀察細胞核出現(xiàn)致密濃染的程度。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1慢病毒預感染效果

熒光圖結(jié)果顯示，PC12細胞在MOI=1時無感染效果，助感染組與空白感染組相比感染效果無明顯差異；MOI=10時有較低感染效果，助感染組與空白感染組相比感染效果無明顯差異；MOI=100時感染效果最強，助感染組PC12細胞感染效果高于空白感染組，見圖1。

圖1 2組PC12細胞的病毒感染效果(200×)Fig.1 Transfection efficiency of PC12 cells in the two groups(200×)

2.2Seipin蛋白敲低效果

Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，Seipin敲低組Seipin蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但陰性對照組Seipin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3TUNEL凋亡染色

TUNEL染色后結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，Seipin敲低組紅色熒光的凋亡細胞明顯增加，見圖3。

2.4Hoechst凋亡染色

Hoechst染色結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，Seipin敲低組細胞的細胞核致密濃染或碎塊狀致密濃染程度明顯增多，見圖4。

注：A為Western blot目的條帶，B為Seipin蛋白灰度條圖；(1)與正常組比較，P<0.05。圖2 各組PC12細胞Seipin蛋白表達Fig.2 The expression of Seipin in PC12 cells of the different groups

圖3 TUNEL法檢測PC12細胞凋亡(200×)Fig.3 TUNEL assay for apoptosis in PC12 cells(200×)

陰性對照組 Seipin敲低組圖4 Hoechst法檢測PC12細胞凋亡(200×)Fig.4 Hoechst assay for apoptosis in PC12 cells(200×)

3 討論

PD又叫震顫性麻痹，隨著年齡的增長,發(fā)病率呈逐年上升，給家庭和社會都帶來很大的經(jīng)濟負擔，老年人的生活質(zhì)量也受到了影響，在臨床診斷上表現(xiàn)為DA能神經(jīng)元的退行性丟失以及神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)的LB，其治療局限于預防對癥治療，不能有效地阻斷疾病的進展[2]。PD的病因和發(fā)病機制十分復雜，至今未明，可能是氧化應激過度、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集等多種機制，最終通過多種級聯(lián)反應導致DA能神經(jīng)元變性死亡；而歷年來的研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在PD發(fā)病過程起著重要作用[3]。Seipin/BSCL2于2001年首次被確定為BSCL2的致病基因[4]，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完整膜上，目前預測其有2個跨膜結(jié)構(gòu)域，一個是腔內(nèi)環(huán)，另一個是胞質(zhì)內(nèi)氨基和羧基末端[5]；Seipin對脂肪形成起著重要作用，其功能缺陷可以嚴重損害脂肪細胞穩(wěn)態(tài)，并導致脂肪代謝障礙[13]。現(xiàn)在有研究顯示Seipin缺陷也有潛在的神經(jīng)受累[14-17]，如PD、Alzheimer Disease及Celia's Encephalopathy 等疾病中[18-20]。因此，Seipin可能是一種調(diào)節(jié)神經(jīng)元疾病的關鍵分子，在神經(jīng)退行性疾病中Seipin的生物學功能研究是該類疾病研究的新方向。

為探討Seipin蛋白表達降低后對細胞凋亡的影響，本研究采用神經(jīng)退行性疾病模型細胞PC12，用基因干擾技術下調(diào)其Seipin蛋白的表達。預感染試驗結(jié)果顯示，PC12細胞在MOI=1時無感染效果，助感染組與空白感染組相比感染效果無明顯差異；MOI=10時有較低感染效果，助感染組與空白感染組相比感染效果無明顯差異；MOI=100時感染效果最強，助感染組PC12細胞感染效果高于空白感染組，提示PC12細胞用MOI=100計算病毒量來感染，助感染試劑能增加感染效率。Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，Seipin敲低組Seipin蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組Seipin蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示成功構(gòu)建Seipin敲低細胞，陰性對照細胞與正常細胞無差異。TUNEL染色后熒光圖結(jié)果表明，與陰性對照組相比，Seipin敲低組顯示紅色熒光的凋亡細胞明顯增加，說明Seipin敲低后細胞發(fā)生凋亡的水平增加。Hoechst染色結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，Seipin敲低組細胞的細胞核致密濃染或碎塊狀致密濃染程度明顯增多，正常細胞的細胞核經(jīng)染色后會呈淡藍色，凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白[21]，說明Seipin蛋白敲低后細胞凋亡增加。以往研究顯示細胞中Seipin發(fā)生突變會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，最終導致錯誤折疊蛋白反應和細胞死亡[22]；體內(nèi)實驗結(jié)果也表明，小鼠敲除Seipin后，隨著年齡的增長，運動發(fā)生明顯障礙且有運動神經(jīng)元的丟失[23]。這些實驗結(jié)果表明Seipin的缺乏可以導致細胞維持正常的生物學功能受到影響，從引起細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建大鼠PC12 Seipin敲低細胞，下調(diào)Seipin蛋白會增加細胞凋亡。