呂菊,謝鵬,任真奎,3,胡玉梅,張春林,吳昌學(xué)，焦玲,禹文峰**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004；3.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，貴州 興義 562400；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；5.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550004)

帕金森病(parkinson disease，PD)是影響中老年人生活質(zhì)量的神經(jīng)退行性疾病，震顫、肌張力增高及運(yùn)動(dòng)遲緩是PD的主要臨床特征，黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元病變死亡和殘存的嗜酸性小體-路易小體(lewy body，LB)是其主要病理特征[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PD與Seipin這一新蛋白相關(guān)，但具體機(jī)制不明確，探索Seipin在PD中的具體機(jī)制可為防治PD及延緩其進(jìn)展提供新的治療方案。Seipin是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，最初被認(rèn)為是先天性全身性脂肪代謝障礙2型疾病(congenital generalized lipodystrophy type 2，CGL2)的基因編碼的蛋白[2]，與脂肪細(xì)胞分化、脂肪分解及脂滴大小的形成相關(guān)[3]。正常情況下，Seipin在人腦的某些區(qū)域(脊髓、額葉皮質(zhì)，以及與能量平衡調(diào)節(jié)有關(guān)的區(qū)域)中高度表達(dá)[4]；研究已經(jīng)表明，Seipin在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮作用[5-7]。提示Seipin可能與神經(jīng)疾病有一定關(guān)系，但是參與這些功能的確切信號(hào)和分子機(jī)制不完全清楚。由于Seipin蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，發(fā)生突變的Seipin可激活細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)途徑并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。因此，推測(cè)Seipin和這些疾病的發(fā)生與ERS介導(dǎo)的細(xì)胞死亡密切相關(guān)；而ERS在PD的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，當(dāng)神經(jīng)元發(fā)生損傷會(huì)引起ERS所致的細(xì)胞凋亡[9]。6-羥多巴胺(6-Hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA)是構(gòu)建PD模型的經(jīng)典藥物，PC12是經(jīng)典的PD模型細(xì)胞[9]。本研究采用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的Seipin敲低PC12細(xì)胞，研究Seipin敲低對(duì)細(xì)胞凋亡的影響和可能涉及的機(jī)制及其對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型的影響。

1 材料與方法

1.1材料

Seipin敲低細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室前期在PC12細(xì)胞中用Seipin-shRNA目的病毒和陰性對(duì)照病毒構(gòu)建的穩(wěn)定株；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶及雙抗(青霉素和鏈霉素)購自美國(guó)Gibico，6-OHDA購于美國(guó)Sigma公司，兔抗GRP78、CHOP、Bax、兔二抗、鼠二抗和裂解液均購自美國(guó)CST公司，鼠抗β-actin抗體購自中國(guó)愛必信生物科技公司，CCK8試劑盒購自日本東仁公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和CCK8法篩選6-OHDA最適濃度 PC12細(xì)胞使用含有胎牛血清(10%)和雙抗(1%)的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，等細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%左右時(shí)，消化并接種細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)使用的方法篩選6-OHDA最適濃度[10]。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞并將細(xì)胞按1×107個(gè)/L接種至96孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，對(duì)細(xì)胞給予不同濃度的6-OHDA(0、25、50、75、100及125 μmol/L)處理；0 μmol/L即不加6-OHDA處理的正常對(duì)照組，每個(gè)組6個(gè)復(fù)孔，每個(gè)組加入對(duì)應(yīng)濃度 6-OHDA的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后，用無血清培養(yǎng)基稀釋的10% CCK8試劑孵育1 h；用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度值，導(dǎo)出并分析數(shù)據(jù)，選定最適的6-OHDA造模濃度。

1.2.2造模與實(shí)驗(yàn)分組 前期研究已證明正常PC12細(xì)胞與陰性對(duì)照細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以本研究將陰性對(duì)照細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞，分別將陰性對(duì)照細(xì)胞和Seipin敲低細(xì)胞再分為正常組和PD模型組，即正常組的陰性對(duì)照細(xì)胞和Seipin敲低細(xì)胞僅給予無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，PD模型組陰性對(duì)照細(xì)胞和Seipin敲低細(xì)胞用含75 μmol/L 6-OHDA的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，處理18 h；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western blot 將提取的蛋白樣品與適量的5×Buffer混勻，沸水煮沸5～10 min，4 ℃冷卻備用；用12%的SDS-PAGE凝膠電泳40 mA，用PVDF膜作為轉(zhuǎn)模濾紙冰浴轉(zhuǎn)模，200 mA 2 h；5%的脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗滌2次，5 min/次；將一抗GRP 78(1 ∶1 000，CST，USA)，CHOP(1 ∶1 000，CST，USA)，Bax(1 ∶1 000，CST，USA)和β-actin(1 ∶1 000，absin,中國(guó))4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，5 min/次；對(duì)應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次。用曝光儀獲取GRP 78、CHOP、Bax和β-actin的圖像結(jié)果，ImageJ計(jì)算蛋白條帶灰度值，總蛋白以β-actin 為內(nèi)部參照進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.16-OHDA的最適濃度

CCK8結(jié)果顯示，不同濃度6-OHDA處理細(xì)胞18 h后，細(xì)胞存活率呈濃度依賴性降低(圖1)。當(dāng)6-OHDA 濃度為75 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為50%左右；在6-OHDA濃度為100 μmol/L和125 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此選擇75 μmol/L的6-OHDA 濃度作為觀察濃度。

注：(1)與0 μmol/L 6-OHDA組比較，P<0.05。圖1 不同濃度6-OHDA處理的PC12細(xì)胞存活率Fig.1 The effect of 6-OHDA on cell viability of PC12 cells

2.2細(xì)胞ERS蛋白GRP 78和CHOP水平

Western blot結(jié)果顯示，與陰性正常組比較，陰性模型組、Seipin模型組應(yīng)激蛋白GRP 78和CHOP明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與陰性模型組相比，Seipin模型組GRP 78和CHOP蛋白水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。提示Seipin敲低后應(yīng)激蛋白GRP 78和CHOP可明顯增加。

注：(1)與陰性正常組比較，P<0.05;(2)與陰性模型組比較，P<0.05。圖2 各組細(xì)胞GRP 78和CHOP表達(dá)水平Fig.2 The protein expression level of GRP 78 and CHOP in each group of cells

2.3細(xì)胞促凋亡蛋白Bax水平

Western blot結(jié)果顯示，與陰性正常組比較，陰性模型組、Seipin模型組促凋亡蛋白Bax明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與陰性模型組相比，Seipin模型組Bax蛋白水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。提示Seipin敲低后促凋亡蛋白Bax明顯增加。

注：(1)與陰性正常組比較，P<0.05; (2)與陰性模型組比較，P<0.05。圖3 各組細(xì)胞Bax表達(dá)水平Fig.3 The effect of 6-OHDA and Seipin knockdown on the protein expression level of Bax

3 討論

PD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以往的研究多集中在神經(jīng)元病變死亡，lewy body[11-12]和α-突觸核蛋白病理學(xué)[13-14]。腦內(nèi)DA能神經(jīng)元逐漸病變死亡，使患者控制肌肉的能力越來越受到限制，當(dāng)黑質(zhì)中DA能神經(jīng)元丟失50%以上，紋狀體內(nèi)DA含量減少至80%以上，臨床上才會(huì)表現(xiàn)出PD的運(yùn)動(dòng)癥狀，主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)反射障礙[12]；PD除了運(yùn)動(dòng)癥狀之外，還伴有一些非運(yùn)動(dòng)癥狀，許多非運(yùn)動(dòng)性癥狀是由路易小體中主要成分α-突觸核蛋白的錯(cuò)誤折疊和廣泛分布所引起的[13]，但是基于這些病理機(jī)制的治療手段沒有取得重大進(jìn)展[15]。PD研究的宗旨是尋找有效地能緩解或阻止神經(jīng)元病變死亡的藥物或治療手段。PD的病因和發(fā)病機(jī)制至今還很復(fù)雜，可能的假說是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度活化、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集等多種機(jī)制，最終通過多種級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性死亡；其中ERS在PD病發(fā)病過程起著重要作用[9]；ERS是指細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂導(dǎo)致未折疊蛋白與異常蛋白大量聚集，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的失衡；當(dāng)細(xì)胞本身不能應(yīng)對(duì)這些異常時(shí)，就會(huì)過度活化ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Seipin蛋白與細(xì)胞ERS功能密切相關(guān)，在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用，其在帕金森病的發(fā)病機(jī)制研究中越來越顯示著重要意義，Seipin的探討也成為目前眾多科學(xué)研究的一個(gè)新方向[5]。

Seipin蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，目前預(yù)測(cè)其有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，過去的研究表明Seipin蛋白在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和維持脂滴形態(tài)中起保護(hù)作用，Seipin蛋白的缺乏會(huì)損害脂肪細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并導(dǎo)致脂肪代謝障礙[16-17]，隨著研究地深入，發(fā)現(xiàn)Seipin在大腦中也高度表達(dá)，Seipin發(fā)生異常會(huì)使神經(jīng)受累，表明Seipin在腦神經(jīng)元中可能具有重要的功能[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，Seipin是神經(jīng)元疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[20-24]。Seipin可能調(diào)控ERS在相關(guān)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)突變的Seipin增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78和CHOP 的增加，并誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡[8]，Seipin的N88S/S90L位點(diǎn)突變和Seipin敲除小鼠也表現(xiàn)出輕度的ERS[25]。為探討Seipin蛋白表達(dá)降低后在6-OHDA誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用陰性對(duì)照細(xì)胞與Seipin敲低細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行6-OHDA造模。CCK8結(jié)果顯示，不同濃度6-OHDA 處理細(xì)胞18 h后，細(xì)胞存活率呈濃度依賴性降低，當(dāng)6-OHDA 濃度為75 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為50%左右(P<0.05)，6-OHDA 濃度為100 μmol/L和125 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸降低，根據(jù)細(xì)胞損傷程度適中的原則，因?yàn)檫^度的細(xì)胞損傷會(huì)造成不可逆損傷，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以濃度為75 μmol/L的6-OHDA作為PD造模濃度。Western blot 結(jié)果顯示，與陰性正常組相比，Seipin敲低后應(yīng)激蛋白GRP 78和CHOP增加，促促凋亡蛋白Bax增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；加6-OHDA處理后，與陰性正常組相比，陰性模型組GRP 78和CHOP蛋白明顯增加(P<0.05)，與陰性模型組相比，Seipin模型組GRP 78和CHOP蛋白水平明顯增加，Bax蛋白水平明顯增加(P<0.05)，說明Seipin蛋白敲低后能誘導(dǎo)ERS，在同樣經(jīng)過6-OHDA處理后，敲低Seipin后ERS蛋白與促凋亡蛋白明顯增加，表明Seipin蛋白可能是維持ERS正常功能的重要分子，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過6-OHDA處理，細(xì)胞產(chǎn)生過度的ERS進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如果細(xì)胞缺乏Seipin蛋白的調(diào)控，會(huì)導(dǎo)致更加嚴(yán)重的ERS進(jìn)而介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加嚴(yán)重。這些結(jié)果表明，在PD模型中Seipin敲低可能與ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切有關(guān)。

綜上所述，敲低Seipin誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能涉及ERS通路的增加，敲低Seipin后導(dǎo)致6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加嚴(yán)重。在未來的研究中仍需要更進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來闡明Seipin參與介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的詳細(xì)機(jī)制。