蒲瑞陽，史典，劉莎，程寧

(蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

動(dòng)物模型是研究2型糖尿病發(fā)病機(jī)制和藥物評價(jià)的常用方法，其中高熱量飲食加適量鏈脲佐菌素(STZ)破壞部分胰島細(xì)胞的方法與人類2型糖尿病發(fā)病機(jī)制相似，且造模周期短、造模后相對可靠穩(wěn)定，是目前常用的T2DM造模方法[1]。但是至今為止，國內(nèi)外對T2DM造模的方法仍沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，大多數(shù)研究中STZ劑量及血糖評價(jià)時(shí)間點(diǎn)和成模后血糖標(biāo)準(zhǔn)也都各不相同[1-2]。

此外，血糖干預(yù)評價(jià)的時(shí)間點(diǎn)和血糖標(biāo)準(zhǔn)也是影響2型糖尿病模型是否成功的關(guān)鍵。很多研究中選擇造模后空腹血糖(FPG)大于7.8 mmol/L或隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L作為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)[3-5]，也有研究選擇空腹血糖大于11.1 mmol/L[2]。至于哪種評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)更合理，并沒有明確的標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)探討性研究。很多研究也會通過口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)來判斷模型是否為2型糖尿病，而且OGTT也是臨床診斷糖尿病最常用的實(shí)驗(yàn)[6]。但是糖尿病造模及藥物干預(yù)過程中，需頻繁測血糖，但OGTT不適合大批量頻繁監(jiān)測，因此，本研究提出在早上固定時(shí)間禁食2 h，評估餐后2 h血糖作為T2DM小鼠模型血糖干預(yù)評價(jià)點(diǎn)，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究和穩(wěn)定性分析，為今后2型糖尿病模型的建立和評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

70只SPF級雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體重18 ～ 20 g，購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所【SCXK(甘)2015-0001】。小鼠飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(甘)2018-0002】，動(dòng)物房室溫20 ～ 25℃，濕度30% ～ 60%，12 h明暗交換。動(dòng)物自由進(jìn)食、進(jìn)水，開始實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑與儀器

避光稱取所需的STZ(美國Sigma-Aldrich 公司，批號S0130)，在避光、冰浴條件下用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2，濃度0.1 mmol/L)溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用，并于10 min內(nèi)注射完畢。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠模型制備

取30只小鼠，給予普通小鼠維持飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)將小鼠分為正常對照組(n=10)和造模組(n=20)，正常對照繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料喂養(yǎng)(高脂飼料各成分含量是在65%大小鼠維持飼料基礎(chǔ)上，添加10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1%膽酸鈉、1%礦物質(zhì)混合物、0.5%維生素混合物，購自北京博愛港商貿(mào)有限公司)，連續(xù)喂養(yǎng)4周后，造模組以50 mg/kg STZ劑量造模，禁食不禁水12 h，連續(xù)腹腔注射3次，隔3天測血糖，繼續(xù)禁食后腹腔注射2次。在完成5次STZ注射后第7天，測定小鼠空腹血糖及餐后2 h血糖,以造模小鼠出現(xiàn)明顯“三多一少”癥狀，且血糖達(dá)到空腹血糖大于7.8 mmol/L，餐后2 h血糖大于11.1 mmol/L為造模成功。

1.2.2 空腹血糖測定

采用ACCU-CHEK? Performa(德國羅氏公司)羅氏血糖儀及試紙條測定兩組小鼠連續(xù)空腹血糖。隨機(jī)選取已成功造模的糖尿病小鼠及正常小鼠各10只，并統(tǒng)一剪趾標(biāo)記。兩組小鼠夜間禁食12 h，測定空腹血糖。3 d后，測定兩組小鼠日間連續(xù)空腹血糖，即夜間正常飲食，次日早晨8:00換籠、撤食、不撤水，并開始測定0時(shí)血糖，每隔1 h測1次血糖，連續(xù)測定4 h內(nèi)的血糖，之后每兩小時(shí)測定1次血糖，連續(xù)4次直至完成12 h內(nèi)小鼠連續(xù)血糖。

1.2.3 隨機(jī)血糖測定

次日將上述方法1.2.2中的兩組小鼠自由給食給水，于上午8：00開始測定0時(shí)血糖，每隔1 h測1次血糖，連續(xù)測定4 h內(nèi)的血糖，之后每2 h測定1次血糖，連續(xù)4次直至完成12 h內(nèi)小鼠連續(xù)血糖。

1.2.4 餐后2 h血糖長期觀察

另取40只小鼠制備T2DM小鼠模型(方法同1.2.1)。同時(shí)以8只正常小鼠為空白對照。觀察兩組小鼠連續(xù)7周內(nèi)餐后2 h的血糖及體重變化，每周測1次。作每周血糖及體重波動(dòng)散點(diǎn)圖，觀察糖尿病小鼠血糖穩(wěn)定性，探討餐后2 h作為評價(jià)T2DM小鼠模型血糖評價(jià)點(diǎn)的可行性及穩(wěn)定性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 T2DM組及對照組小鼠造模前后空腹血糖及體重

20只小鼠以50 mg/kg STZ按上述方法所述注射5次完成造模，并測定造模完成后5日血糖，其中餐后2 h血糖大于11.1 mmol/L的16只，其余4只小于10 mmol/L，成模率80%。隨機(jī)選取10只成模小鼠作為模型組，分別測定對照組與模型組小鼠造模前后體重和空腹血糖。如圖1所示，造模前兩組小鼠體重?zé)o差異(P> 0.05)，造模過程中兩組小鼠經(jīng)過4周喂養(yǎng)，對照組與T2DM組小鼠體重分別為(24.0 ± 1.0)g和(23.8 ± 0.98)g，體重明顯上升(P< 0.0001)。注射STZ造模后，T2DM組小鼠體重下降至(23.2 ± 0.53)g，與正常組小鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01);空腹血糖分析結(jié)果顯示，造模前兩組小鼠空腹血糖無差異。糖尿病小鼠造模前后血糖分別為(7.1 ± 1.02)mmol/L和(9.1 ± 2.55)mmol/L, 血糖變化明顯(P< 0.05); 造模后糖尿病小鼠與正常組小鼠空腹血糖差異具有顯著性(P< 0.05)。

注：(A)T2DM組造模后體重與造模前相比顯著增加，****P < 0.0001；造模后，T2DM組體重與正常對照組相比明顯降低，**P < 0.01。(B) 造模后T2DM組空腹血糖與造模前相比明顯升高，*P< 0.05；造模后T2DM組空腹血糖與正常對照組相比明顯升高，*P < 0.05。圖1 造模前后糖尿病組和正常組小鼠體重與空腹血糖Note. (A) The weight of T2DM group was significantly higher than before modeling，****P <0.0001. Compared with the control group, the weight of T2DM group decreased significantly after modeling, **P< 0.01. (B) The FPG of T2DM group was significantly higher than before modeling，*P < 0.05.Compared with the control group, the FPG of T2DM group increased significantly after modeling, *P < 0.05.Figure 1 Body weight and FPG of diabetic and normal mice before and after modeling

2.2 T2DM組及正常組小鼠連續(xù)空腹血糖

T2DM組小鼠從0 h撤去食物后至1 h血糖迅速下降；2 ～ 3 h期間，血糖變化相對穩(wěn)定，并一直處于較高水平?？崭? h后血糖大幅下降，此后6 ～ 8 h糖尿病小鼠血糖持續(xù)降低，至12 h，血糖降至12.4 mmol/L。 T2DM組小鼠空腹4 ～ 12 h期間降幅超過7 mmol/L。然而正常組小鼠禁食12 h期間血糖穩(wěn)定在正常范圍內(nèi)，主要變化趨勢為禁食1 h以后逐漸緩慢下降，空腹4 h后輕微上升，4 ～ 12 h期間波動(dòng)幅度不超過1 mmol/L，如圖2所示。

圖2 糖尿病小鼠及正常組小鼠連續(xù)空腹血糖Figure 2 Continuous fasting glucose in diabetic mice and normal mice

2.3 糖尿病小鼠及正常小鼠連續(xù)隨機(jī)血糖

兩組小鼠自由飲食飲水，自8:00開始測12 h內(nèi)連續(xù)隨機(jī)血糖，血糖變化如圖3所示。T2DM組小鼠在不禁食狀態(tài)下，血糖隨著小鼠進(jìn)食變化較大，8 ～ 12 h期間血糖相對穩(wěn)定在較高水平，可能是受小鼠進(jìn)食規(guī)律的影響。因此總體來說，正常組小鼠隨機(jī)血糖穩(wěn)定在正常范圍內(nèi)，而T2DM小鼠隨機(jī)血糖波動(dòng)較大。

2.4 T2DM造模組小鼠及對照組小鼠7周內(nèi)體重及餐后2 h血糖變化

40只T2DM造模組小鼠中死亡2只，造模完成第4周餐后2 h血糖 > 11.1 mmol/L的32只，成模率為80%，存活率95%。7周內(nèi)40只T2DM造模組小鼠及對照組小鼠體重及餐后2 h血糖結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了餐后2 h血糖作為評價(jià)2型糖尿病模型血糖評價(jià)點(diǎn)的可靠性和穩(wěn)定性，如圖4及圖5所示。圖4顯示T2DM小鼠在造模完成后一周血糖有上升趨勢，第4周開始血糖持續(xù)穩(wěn)定且明顯高于對照組。T2DM組小鼠在造模后的2周內(nèi)體重會明顯降低，第4周開始逐漸恢復(fù)并保持穩(wěn)定，而對照組小鼠7周的血糖和體重均處于穩(wěn)定狀態(tài)。由此可見，餐后2 h血糖可以相對準(zhǔn)確地反映糖尿病模型中血糖變化情況及模型的穩(wěn)定性。

3 討論

目前國內(nèi)外研究中2型糖尿病模型造模標(biāo)準(zhǔn)不一，盡管很多通過探討不同STZ劑量、注射次數(shù)來評價(jià)及優(yōu)化造模條件，但由于各實(shí)驗(yàn)室具體環(huán)境、小鼠批次等因素的影響，各個(gè)研究間STZ劑量和注射次數(shù)仍然不完全統(tǒng)一，值得注意的是各研究中評價(jià)模型的血糖標(biāo)準(zhǔn)也各不相同[7-9]。STZ劑量和次數(shù)可以根據(jù)每次試驗(yàn)的具體情況通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定，但模型血糖評價(jià)點(diǎn)和評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)理應(yīng)是固定且穩(wěn)定的。遺憾的是，并沒有相關(guān)研究詳細(xì)闡述糖尿病模型的血糖標(biāo)準(zhǔn)，很多研究也并沒有說明選擇血糖評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)，導(dǎo)致多數(shù)研究盲目從眾選擇, 造成糖尿病模型評價(jià)沒有廣泛認(rèn)同的標(biāo)準(zhǔn)，給糖尿病模型及相關(guān)研究造成了一定的困難。

圖3 糖尿病小鼠與正常組小鼠連續(xù)隨機(jī)血糖Figure 3 Continuous random blood glucose in diabetic mice and normal mice

圖4 糖尿病小鼠及對照組小鼠連續(xù)7周內(nèi)餐后2 h血糖變化圖Figure 4 Changes in 2 h postprandial blood glucose within 7 consecutive weeks of diabetic mice and normal mice

圖5 糖尿病小鼠及對照組小鼠連續(xù)7周內(nèi)體重變化圖Figure 5 Changes in body weight of diabetic mice and normal mice within 7 consecutive weeks

研究發(fā)現(xiàn)STZ是誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡造成胰島功能損傷的，大劑量STZ注射會造成胰島β細(xì)胞大量破壞而出現(xiàn)1型糖尿病[6]。最近T2DM小鼠模型的相關(guān)研究中，作者張吟等以空腹12 h血糖 > 11.1 mmol/L為T2DM成模標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為高劑量STZ造模后空腹血糖持續(xù)在25 ～ 30 mmol/L，胰腺病理顯示胰島細(xì)胞大部分萎縮，胰島體積明顯縮小數(shù)量減少是理想的T2DM模型；但認(rèn)為100 mg/kg STZ造模后，血糖雖> 11.1 mmol/L，但期間會上下波動(dòng)，胰腺病理結(jié)果顯示胰腺輕微損傷的模型效果不佳[2]。而本研究認(rèn)為前者可能已經(jīng)成為1型糖尿病模型；恰恰是后者的情況，比較符合本研究前期遇到的問題，即造模完成后，小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的“三多一少”糖尿病癥狀，口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)中2 h血糖也> 11.1 mmol/L，但夜間禁食12 h后小鼠空腹血糖仍然達(dá)不到造模標(biāo)準(zhǔn)，或者空腹血糖持續(xù)升高時(shí)，小鼠已經(jīng)有成為1型糖尿病的可能。因此，T2DM模型中，是否應(yīng)一味追求空腹高血糖，還是應(yīng)該尋找一個(gè)合理的血糖評價(jià)點(diǎn)？為進(jìn)一步探索理想的血糖評價(jià)點(diǎn)，我們設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并測定白天連續(xù)空腹血糖和連續(xù)隨機(jī)血糖，分析小鼠血糖規(guī)律，以此尋找糖尿病小鼠血糖最佳評價(jià)點(diǎn)。

本研究通過連續(xù)空腹血糖和連續(xù)隨機(jī)血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)合實(shí)際造模經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出了T2DM小鼠不同于正常小鼠的血糖變化規(guī)律。對于正常C57BL/6小鼠，不論是夜間禁食12 h的空腹血糖，還是白天禁食的連續(xù)空腹血糖，其血糖均能維持在正常范圍內(nèi)，不會出現(xiàn)較大的變化，這一結(jié)果與大部分研究中對照組血糖結(jié)果相符[2, 10]。但對于T2DM小鼠，由于糖尿病引起的血糖調(diào)節(jié)失衡，不能正常調(diào)節(jié)血糖，如果長時(shí)間夜間禁食，會導(dǎo)致空腹血糖過低而造成模型評價(jià)失真的情況。由于隨機(jī)血糖不能確定小鼠進(jìn)食的時(shí)間，有可能造成隨機(jī)血糖大幅波動(dòng)，也不利于T2DM模型的評價(jià)。本研究中，從T2DM小鼠連續(xù)空腹血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，對于造模體重在25 g左右的T2DM小鼠，白天禁食2 ～ 3 h期間血糖變化趨勢相對穩(wěn)定，且能較好反應(yīng)真實(shí)的T2DM小鼠血糖情況，故選擇餐后2 h血糖作為T2DM小鼠血糖評價(jià)點(diǎn)。

很多研究中也會通過OGTT判斷糖尿病模型動(dòng)物血糖情況[11-12]，但鑒于OGTT操作復(fù)雜，并不適用于長期頻繁監(jiān)測以評價(jià)模型穩(wěn)定性和藥效。蔡清顏等在西格列汀對2型糖尿病小鼠降脂及改善炎癥反應(yīng)的研究中，以餐后2 h血糖> 16.7 mmol/L為T2DM造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，但并未說明選擇這一標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)[13]。本實(shí)驗(yàn)中之所以選取餐后2 h為糖尿病小鼠血糖評價(jià)點(diǎn)，不僅是根據(jù)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)后得出的小鼠血糖規(guī)律，而且更接近臨床OGTT實(shí)驗(yàn)和臨床餐后2 h血糖。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證餐后2 h血糖評價(jià)T2DM小鼠模型血糖的穩(wěn)定性，本研究連續(xù)監(jiān)測40只糖尿病造模組小鼠和8只對照組小鼠7周內(nèi)餐后2 h血糖和體重，發(fā)現(xiàn)餐后2 h血糖能穩(wěn)定反應(yīng)2型糖尿病模型的血糖情況，。由于STZ造模后對小鼠機(jī)體的短期傷害，小鼠體重會在造模后1 ～ 2周內(nèi)明顯下降，T2DM組小鼠在造模后出現(xiàn)明顯的血糖上升，同時(shí)伴體重降低，隨著模型的穩(wěn)定，小鼠體重也趨于穩(wěn)定，而正常組小鼠7周內(nèi)血糖和體重都相對穩(wěn)定，這一結(jié)果與大部分糖尿病模型長期觀察的結(jié)果基本吻合[2, 14]。

綜上所述，本研究首次通過連續(xù)12 h空腹血糖監(jiān)測，初步得出T2DM小鼠空腹血糖變化規(guī)律，并通過長期監(jiān)測驗(yàn)證了餐后2 h血糖作為評價(jià)T2DM模型血糖的穩(wěn)定性，因此，餐后2 h血糖在評價(jià)小鼠T2DM模型中具有較好的實(shí)驗(yàn)血糖干預(yù)評價(jià)應(yīng)用價(jià)值，為今后2型糖尿病C57BL/6小鼠模型造模及評價(jià)提供了可靠的依據(jù)，同時(shí)，對其他動(dòng)物類型的T2DM模型也有參考和借鑒價(jià)值。

[收稿日期]2019-08-31