呂建敏，龔金炎，劉士旺

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053； 2. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院/輕工學(xué)院，杭州 310023)

原發(fā)性肝癌位居全球腫瘤死亡率第2位[1]，常用的手術(shù)和西藥療法存在療效欠佳且藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重等問(wèn)題，而副作用較小的中草藥抗癌制劑在腫瘤輔助治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[2]。小鼠肝癌22(H22)是最常用的小鼠可移植性腫瘤細(xì)胞系之一，廣泛用于腫瘤動(dòng)物模型復(fù)制，在中草藥抗腫瘤藥效學(xué)評(píng)價(jià)中發(fā)揮著重要作用[3-5]。秀珍菇Pleurotusgeesteranus是一種珍稀的藥食兼用食用菌，隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬[6]，研究發(fā)現(xiàn)，秀珍菇中所含多糖具有抗氧化、抗炎、抗衰老、保護(hù)肝等藥理功效[7-10]。盡管目前已利用H22荷瘤小鼠模型證實(shí)許多藥食兼用食用菌及其提取物具有抗腫瘤功效，且其抑瘤作用主要源于食用菌中的活性成分對(duì)機(jī)體免疫和抗氧化功能的改善[11-13]，但對(duì)秀珍菇的相關(guān)研究仍主要集中在多糖提取及其他藥理作用上[7-10]，還鮮有秀珍菇抗腫瘤作用的報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，秀珍菇粉具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抗氧化的作用(尚未發(fā)表)，據(jù)此推測(cè)，秀珍菇可能也具有抗腫瘤功效。因此，本研究使用H22荷瘤小鼠模型，研究秀珍菇體內(nèi)抗腫瘤作用效果和機(jī)制，旨在為后續(xù)秀珍菇藥品和功能食品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 秀珍菇粉

新鮮秀珍菇由浙江省縉云縣珍稀食用菌專(zhuān)業(yè)合作社生產(chǎn)，并由浙江科技學(xué)院劉士旺教授鑒定。將新鮮秀珍菇于50 ～ 70℃下烘8 h，磨成粉末，過(guò)40目篩后裝在封口袋中放置于陰涼干燥處保存。秀珍菇粉末主要營(yíng)養(yǎng)成分經(jīng)綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 秀珍菇粉主要營(yíng)養(yǎng)成分表Table 1 Nutrient values of Pleurotus geesteranus fuit body powder

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株

60只雄性SPF級(jí)ICR小鼠，年齡為4周齡，體重為17 ～ 20 g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2018-0006】。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2018-0012】。飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水，飼喂小鼠維持飼料由儀征安利卯生物科技有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，相對(duì)濕度40% ～ 70%，溫度控制在22 ～ 25℃，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。所有操作均符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(審批號(hào)：IACUC 2018091705)。H22小鼠肝癌瘤株購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心傳代保種。

1.1.3 試劑與儀器

環(huán)磷酰胺(CTX，Meilunbio，M0915A)；注射用氯化鈉(浙江國(guó)鏡藥業(yè)有限公司，B18050702)；小鼠免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)、小鼠細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-2)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(南京建成生物公司，20181206)；SOD、GSH-Px、CAT和MDA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物公司，批號(hào)分別為20181207、20180817、20181205、20181208)。

電子天平(JJ300，常熟雙杰測(cè)試儀器廠)；電子分析天平(Mettler Toledo，瑞士)。酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國(guó))。MICROM AP-280組織包埋機(jī)、MICROM HM-335E型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(MICROM，德國(guó))；LEICA染色機(jī)(LEICA，瑞士)，NanoZoomer -2.0RS數(shù)字切片掃描儀(濱松光電，日本)。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠實(shí)體瘤模型的建立

按常規(guī)方法復(fù)蘇H22小鼠肝癌細(xì)胞，取0.2 mL細(xì)胞懸液注射到雄性ICR小鼠腹腔內(nèi)，連續(xù)傳兩代獲得H22腹水瘤小鼠，用于本實(shí)驗(yàn)。依據(jù)參考文獻(xiàn)[12, 14]的方法，在超凈工作臺(tái)中，取H22腹水瘤小鼠的腹水，經(jīng)生理鹽水清洗后稀釋成濃度為 1×106/mL細(xì)胞懸液，按每只0.2 mL接種劑量接種于經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的ICR小鼠左側(cè)腋部皮下。

1.2.2 分組、給藥

ICR小鼠接瘤24 h后隨即分組，即模型組(Modle)、環(huán)磷酰胺陽(yáng)性藥組(CTX)、秀珍菇低(PGP-L)、中(PGP-M)、高(PGP-H)劑量組，每組10只小鼠，另取10只正常小鼠作為空白對(duì)照組(Blank)。依據(jù)參考文獻(xiàn)[12,15]設(shè)置CTX和秀珍菇給藥劑量，空白組不給藥及生理鹽水，模型組灌服生理鹽水，陽(yáng)性藥組隔天按20 mg/kg 體重的劑量腹腔注射CTX生理鹽水溶液，秀珍菇低、中、高劑量組分別按750、1500和3000 mg/kg 體重每天劑量灌服秀珍菇粉生理鹽水混懸液。各組小鼠接種瘤株后第2天開(kāi)始給藥，給藥容量為 0.2 mL/10 g，連續(xù)給藥10 d。

1.2.3 腫瘤抑制率和臟器指數(shù)測(cè)定

末次給藥24 h后麻醉處死小鼠，剝?nèi)×鰤K，取脾、胸腺，稱(chēng)重并計(jì)算抑瘤率和免疫器官臟器指數(shù)。腫瘤生長(zhǎng)抑制率=(模型組平均瘤重 - 給藥組平均瘤重)/ 模型組平均瘤重×100%；臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體重質(zhì)量(g)×100。

1.2.4 血清免疫球蛋白和細(xì)胞因子測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠頜下靜脈取血，分離血清，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用酶聯(lián)免疫(ELISA)法測(cè)定小鼠血清中 IgA，IgG和 IgM含量及TNF-α，IL-6和IL-2的含量。

1.2.5 肝、腎組織抗氧化指標(biāo)測(cè)定

麻醉處死小鼠，取肝、腎，制備肝、腎勻漿，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定分別測(cè)定小鼠肝、腎中SOD，GSH-Px和CAT的活性及MDA含量。

1.2.6 腫瘤和脾的組織病理學(xué)觀察

分別取各組小鼠瘤塊和脾，置于4%中性甲醛固定，將固定好的組織用常規(guī)石蠟包埋，再將石蠟包埋塊切片、脫蠟，進(jìn)行HE染色，最后用數(shù)字切片掃描儀對(duì)切片進(jìn)行圖像掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H22荷瘤小鼠模型成模和帶瘤生存情況

自接種H22瘤株第3天起，所有荷瘤小鼠腋窩處均出現(xiàn)明顯瘤組織，并逐天增大，表明模型復(fù)制成功。在實(shí)驗(yàn)期間，所有荷瘤小鼠無(wú)自然死亡情況。

2.2 小鼠平均瘤重和腫瘤抑制率

由表2可見(jiàn)，陽(yáng)性藥組及秀珍菇各劑量組小鼠平均瘤重均極顯著低于與模型組(P< 0.01)；腫瘤抑制率以陽(yáng)性藥組最高、秀珍菇高、中劑量組次之，秀珍菇低劑量組最低。

2.3 小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

由圖1可見(jiàn)，與空白組比較，模型組、陽(yáng)性藥組和秀珍菇各劑量組小鼠脾指數(shù)均極顯著升高(P< 0.01)，陽(yáng)性藥組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P< 0.05)。秀珍菇各劑量組小鼠的脾和胸腺指數(shù)都有高于陽(yáng)性藥組的趨勢(shì)，其中高劑量組的脾指數(shù)與陽(yáng)性藥組比較有顯著性差異(P< 0.05)。

表 2 秀珍菇粉對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的的影響Table 2 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on growth of tumor in H22 tumor-bearing mice

注：同列數(shù)值肩標(biāo)上無(wú)字母或有相同字母表示差異不顯著(P> 0.05)，肩標(biāo)上小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P< 0.05)，肩標(biāo)上大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著(P< 0.01)。下表同。

Note. In the same line, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P> 0.05), while values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P< 0.01). The same in the flowing tables.

注：各組間比較，小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P< 0.05)，大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著(P< 0.01)。圖1 秀珍菇粉對(duì)H22荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Note. Compared among groups, values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P< 0.01).Figure 1 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on spleed and thymus indices of H22 tumor-bearing mice

2.4 小鼠血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量

由表3可知，與空白組比較，模型組小鼠血清IgA和TNF-α含量顯著升高(P< 0.01，P< 0.05)，模型組和秀珍菇中劑量組小鼠血清IL-2含量顯著降低(P< 0.01，P< 0.05)，模型組和秀珍菇低、中劑量組小鼠血清IL-6含量有上升趨勢(shì)(P> 0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組和秀珍菇各劑量組小鼠血清IgA和TNF-α含量顯著降低(P< 0.01，P< 0.05)，陽(yáng)性藥組和秀珍菇低劑量組小鼠血清IL-2含量顯著升高(P< 0.05)，秀珍菇高劑量組小鼠血清IL-6含量也顯著低于模型組(P< 0.05)。

2.5 小鼠肝組織抗氧化指標(biāo)

由表4可知，與空白組比較，模型組小鼠肝MDA含量顯著升高(P< 0.05)，GSH-Px和CAT活力極顯著降低(P< 0.01)；陽(yáng)性藥組和秀珍菇各劑量組小鼠肝GSH-Px活性顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組、秀珍菇各劑量組小鼠肝CAT活性均顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，秀珍菇中、高劑量組肝GSH-Px活力顯著高于模型組(P< 0.05)，而秀珍菇中劑量組小鼠肝MDA含量顯著低于模型組(P< 0.05)。

2.6 小鼠腎組織抗氧化指標(biāo)

由表5可知，模型組小鼠腎組織SOD、GSH-Px和CAT活性均顯著低于空白組(P< 0.01，P< 0.05，P< 0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組和秀珍菇各劑量組小鼠腎SOD和CAT活性極顯著升高(P<0.01)，秀珍菇低、中劑量組小鼠腎GSH-Px活性也顯著高于模型組(P< 0.05)。

2.7 荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

由圖2可見(jiàn)，模型組腫瘤細(xì)胞形狀多呈橢圓形，體積大小不同，且排列密集，極少有出血壞死情況；CTX組的腫瘤細(xì)胞排列松散且呈不規(guī)則變形，多數(shù)腫瘤細(xì)胞破裂有明顯的胞漿溢出；秀珍菇各劑量組均可觀察到有腫瘤壞死細(xì)胞，且細(xì)胞形狀不規(guī)則，特別是秀珍菇中、高劑量組出現(xiàn)細(xì)胞破裂、壞死細(xì)胞堆積的情況較為明顯。

表 3 秀珍菇粉對(duì)H22荷瘤小鼠血清免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量的影響Table 3 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on serum contents of immunoglobulins and cytokines in H22 tumor-bearing mice

表 4 秀珍菇粉對(duì)H22荷瘤小鼠肝組織抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on antioxidant indices in liver of H22 tumor-bearing mice

表 5 秀珍菇粉對(duì)H22荷瘤小鼠腎組織抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on antioxidant indices in kidney of H22 tumor-bearing mice

2.8 小鼠脾組織形態(tài)學(xué)觀察

由圖3可見(jiàn)，空白組小鼠脾細(xì)胞排列正常，紅髓與白髓兩者分界清晰，模型組和秀珍菇各劑量組小鼠脾細(xì)胞均較空白組增多，模型組脾紅髓與白髓分界模糊，CTX組和秀珍菇低劑量部分區(qū)域出現(xiàn)脾紅髓與白髓模糊不清現(xiàn)象，秀珍菇中、高劑量組脾紅髓與白髓兩者分界較清晰。

3 討論

3.1 秀珍菇對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

食用菌抗腫瘤作用及有效成分提取近年來(lái)備受關(guān)注[16]，已有研究表明，香菇、灰樹(shù)花、猴頭菇、靈芝等藥食兼用食用菌均具有抗腫瘤功效[11-12, 17-18]，并發(fā)現(xiàn)食用菌中多糖是主要抑瘤活性成分[11,19]。目前有關(guān)秀珍菇及其提取物的藥理作用研究主要側(cè)重于抗氧化、抗炎、保護(hù)肝等方面[7-9]，很少涉及抗腫瘤作用研究，因此，我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)秀珍菇粉具有抗氧化、增強(qiáng)免疫功能的基礎(chǔ)上(還未發(fā)表)，進(jìn)一步研究秀珍菇的抑瘤功效。本研究首先建立H22荷瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠腋部接種H22瘤株3 d后即出現(xiàn)明顯腫塊，病理切片觀察結(jié)果顯示模型組小鼠腫瘤細(xì)胞呈橢圓形，且排列密集，表明腫瘤模型建立成功。研究還發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量秀珍菇均具有的抑瘤效果，秀珍菇中、高劑量組抑瘤率分別達(dá)到47.47%和48.80%，已接近陽(yáng)性藥CTX的抑瘤效果(55.08%)，符合抗腫瘤中草藥有效性的標(biāo)準(zhǔn)(抑瘤率 > 30%)要求[20]。從病理切片上也觀察到荷瘤小鼠經(jīng)秀珍菇處理后出現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞壞死，且壞死區(qū)域明顯增加現(xiàn)象，充分驗(yàn)證了秀珍菇的抑瘤效果。

3.3 秀珍菇對(duì)H22荷瘤小鼠的免疫功能影響

脾指數(shù)和胸腺指數(shù)分別反映體液和細(xì)胞免疫功能[3]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠荷瘤后脾過(guò)度增大，脾細(xì)胞明顯增多，這與荷瘤后各類(lèi)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至脾后滯留有直接的關(guān)系[21]。環(huán)磷酰胺(CTX)主要通過(guò)免疫抑制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[22]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，CTX組小鼠胸腺指數(shù)顯著低于空白組，脾指數(shù)有低于模型組趨勢(shì)，且脾紅髓與白髓模糊不清，而秀珍菇各劑量組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均高于CTX組，且秀珍菇中、高劑量組小鼠脾紅髓與白髓兩者分界也較清晰，說(shuō)明秀珍菇抗腫瘤機(jī)制與CTX不同，可能是通過(guò)保護(hù)免疫器官提高機(jī)體免疫力來(lái)達(dá)到抑瘤固本效果。

圖2 H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞 HE 染色切片(×200)Figure 2 HE stained sections of tumor cells from H22 tumor-bearing mice (×200)

圖3 小鼠脾細(xì)胞HE染色切片(×200)Figure 3 HE stained sections of spleen cells in mice (× 200)

免疫球蛋白是反映機(jī)體體液免疫功能指標(biāo)。研究顯示動(dòng)物荷瘤后血清免疫球蛋白會(huì)發(fā)生異常表達(dá)，導(dǎo)致功能失調(diào)[23]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠荷瘤后血清IgA含量異常升高，而秀珍菇能顯著降低荷瘤小鼠血清IgA水平，說(shuō)明秀珍菇對(duì)荷瘤小鼠體液免疫功能也具有調(diào)節(jié)作用。

TNF-α、IL-2和IL-6等細(xì)胞因子通過(guò)結(jié)合相應(yīng)受體調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，調(diào)控免疫應(yīng)答[24]。一定濃度范圍內(nèi)的TNF-α具有組織修復(fù)功能，但TNF-α濃度異常升高可引起組織損傷[25]。很多腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生TNF-α，反過(guò)來(lái)TNF-α和IL-6等炎性因子又可刺激腫瘤生長(zhǎng)[24]。而IL-2可促進(jìn)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞功能，在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特異性免疫反應(yīng)中起重要作用[26]。在本試驗(yàn)中，小鼠荷瘤后，出現(xiàn)血清TNF-α含量顯著上升，IL-2含量顯著下降，IL-6含量有上升趨勢(shì)等異常改變，而經(jīng)秀珍菇處理后，上述異常改變得到逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明秀珍菇對(duì)荷瘤小鼠細(xì)胞因子水平具有正向調(diào)節(jié)作用。

3.3 秀珍菇對(duì)H22荷瘤小鼠肝、腎組織抗氧化能力的影響

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與宿主的自由基水平及其代謝產(chǎn)物有關(guān)[27-28]。SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性降低會(huì)導(dǎo)致機(jī)體清除自由基能力下降，引起氧自由基和MDA的堆積，造成機(jī)體損傷[29]。本試驗(yàn)觀察到，小鼠荷瘤后，肝MDA含量顯著上升，肝和腎部分抗氧化酶活性顯著降低，而與模型組比較，秀珍菇各劑量組小鼠肝CAT活性及腎SOD和CAT活性顯著升高，秀珍菇中、高劑量組小鼠肝GSH-Px活力及低、中劑量組腎GSH-Px活性均顯著升高，而秀珍菇中劑量組小鼠肝MDA含量顯著降低，表明秀珍菇能顯著提高荷瘤小鼠抗氧化能力，并能清除過(guò)量表達(dá)自由基，從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)和保護(hù)正常組織作用。

綜上所述，秀珍菇可顯著降低荷瘤小鼠平均瘤重，具有較好的抑腫瘤作用，并具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能。由此推測(cè)秀珍菇抗腫瘤的可能機(jī)制為：通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力，清除體內(nèi)過(guò)量自由基，下調(diào)異常升高的血清TNF-α和IL-6水平，減輕自由基和高濃度炎性細(xì)胞因子對(duì)組織損傷，進(jìn)而改善機(jī)體在荷瘤狀態(tài)下的免疫細(xì)胞活性，抑制腫瘤生長(zhǎng)；同時(shí)通過(guò)上調(diào)血清IL-2水平, 間接提高T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡，最終達(dá)到抗腫瘤效果。秀珍菇體內(nèi)抗腫瘤作用也可能還有其他作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。