李明珠，王文萍，金圣博

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110032； 2. 中國醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院 遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽 110042； 3. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，沈陽 110032)

奧沙利鉑是用于消化道惡性腫瘤及婦科惡性腫瘤的常用化療藥物，大約90%的患者在使用此藥后會誘發(fā)特有的急性化療后誘導的神經(jīng)病理性疼痛(chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN)，臨床表現(xiàn)癥狀為疼痛、麻木，手部、足部和口腔周圍的感覺障礙，遇冷引發(fā)或加重，10% ～ 15%患者經(jīng)過多次化療后出現(xiàn)了累積和慢性CIPN，如感覺喪失和運動障礙,嚴重影響患者生活質(zhì)量[1-5]。而中醫(yī)藥憑借獨特的辨證論治理論體系，在防治此病有所建樹[6-7]，是目前研究的熱點，但因其治療機制的探討和研究，仍亟需加強。因此，在機理研究時選擇理想的大鼠CIPN動物模型及檢測方法，已成為CIPN的中醫(yī)防治及病因病機等研究極為關鍵的步驟。目前機理研究中常選用大鼠CIPN模型，但因尚無明確的分類及應用標準，使現(xiàn)有的動物模型無法得到充分合理的運用，對研究結(jié)果的可靠性產(chǎn)生影響。故此文介紹大鼠急性CIPN及慢性CIPN模型的建立方法、評價以及應用，以期為實驗中大鼠CIPN模型的選擇提供參考，從而構(gòu)建出更貼合臨床實際的動物模型,為中西醫(yī)防治腫瘤并發(fā)癥研究創(chuàng)造理想的實驗平臺。

1 奧沙利鉑所致神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型建立的主要方法

大鼠CIPN模型，分為急性模型和慢性模型兩種，急性模型采用單次注射一定劑量奧沙利鉑所誘導，慢性模型采用多次注射一定總量的奧沙利鉑所誘導，常用注射方式為腹腔注射或者鼠尾靜脈注射，急性和慢性的造模方式與臨床上單次化療造成急性CIPN模型和多次化療所造成慢性CIPN模型相一致。注射藥物的方式有鼠尾靜脈注射和腹腔注射兩種方式，腹腔注射主要不良反應為腹膜腫脹[8]，但兩者均有較好的安全性并簡易的操作性。2002年，世衛(wèi)組織推薦奧沙利鉑大鼠使用劑量為每周兩次注射2 ～ 3 mg/kg奧沙利鉑，直至注射9次，在一些學者研究中發(fā)現(xiàn)，奧沙利總使用劑量8 ～ 16 mg/kg大鼠無明顯惡化，體重增長速度和正常對照組無顯著差異，臨床狀況良好[9]，當單次劑量達到4 mg/kg，累積劑量達到32 mg/kg及以上劑量組，可能出現(xiàn)大鼠死亡[9-10]。即根據(jù)奧沙利鉑臨床成人常用劑量(130 mg/m2)，按照動物種屬與用藥轉(zhuǎn)換公式， 換算出大鼠的用藥劑量為20 mg/kg，當劑量達到32 mg/kg換算成人體為180 mg/kg[11]。大鼠接受奧沙利鉑注射后會出現(xiàn)一些行為學變化，如攝食減少、消瘦、體重增長變緩等表現(xiàn)，與注射劑量增加和注射間隔時間長短，呈正相關[9]，并可以出現(xiàn)四肢末端皮膚顏色略蒼白，肌肉萎縮，舔足、抬足活動增加等行為表現(xiàn)，進一步可能出現(xiàn)機械痛閾、冷熱痛閾的改變，研究中可以通過如上的表現(xiàn)來判斷是否造模成功。以下表格詳細敘述常用的急性和慢性造模方式、行為表現(xiàn)及安全性。大鼠均選取SD或Wistar大鼠，雄性或者雌性無明顯差別。見表1-3。

2 成模檢測方法

奧沙利鉑化療后誘導的神經(jīng)病理性疼痛的臨床表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、感覺障礙等，在大鼠CIPN模型中也有所體現(xiàn)，一般通過機械痛閾，冷、熱痛閾的改變，來判斷造模是否成功及治療的有效性評價，下面介紹常用的成模的具體檢測方法：

表1 大鼠神經(jīng)病理性疼痛急性模型Table 1 CIPN acute model of rat

注：i.p： 腹腔注射； i.v： 靜脈注射； CA：冷痛覺； HH：熱痛覺過敏；HHO：熱痛覺； MA：機械痛閾；MH：機械痛覺過敏。 (+)表示這種行為是經(jīng)過評估的，給藥奧沙利鉑后有類似疼痛的行為，(-)表示這種行為是經(jīng)過評估的，但在奧沙利給藥后不明顯。下表同。

Note. i.p,intraperitoneal. i.v, intravenous. CA, cold allodynia. HH, heat hyperalgesia. HHO, heat hypoalgesia. MA, mechanical allodynia. MH, mechanical hyperalgesia. Symbols: (+) indicates presence of pain-like behaviour following oxaliplatin n administration， (-) indicates this behaviour was assessed but not evident following oxaliplatin administration. The same in the following tables.

表2 大鼠神經(jīng)病理性疼痛慢性模型Table 2 CIPN chronic model of rat

表3 大鼠神經(jīng)病理性疼痛造模注射方式Table 3 CIPN model injection method of rat

2.1 機械痛閾檢測方法及測定

2.1.1 蘭德爾壓足試驗疼痛閾值檢測(Randall-Selitto paw-withdrawal test)

在安靜、溫度(20 ～ 22℃)控制的房間內(nèi)，上午10：00～下午4：00 時間內(nèi)，使用Basile Algesy測量儀(芝加哥，伊利諾伊州)檢測大鼠的壓爪閾值。使大鼠爬進帶SLAN的Perspex圓柱形束縛器中，后腿一側(cè)的TED通風孔可自由延伸，實驗前使后腿自由伸展和適應10 ～ 15 min，并暴露于試驗刺激。采用Selitto壓足戒斷試驗-行為實驗方法檢測，疼痛閾值定義為大鼠拔出爪子的克數(shù)。每只爪子作為一種獨立的測量手段，每個實驗在單獨的一組大鼠身上進行，給藥前后測定戒斷閾值(即痛閾值)，每間隔5 min進行1次傷害感受閾值測量，共測量4次，最后3次的平均值記錄為疼痛閾值，戒斷壓力為200 g[12,22-24]。

2.1.2 馮·弗雷纖維絲疼痛閾值檢測(Von Frey hair)

因其簡易操作，重復性高，此為最常用的檢測方式。在安靜、舒適房間內(nèi)，將大鼠放置于高架金屬篩網(wǎng)上，15 min適應環(huán)境，從下面使用硬性Von Frey纖維絲(0.6、1、1.4、2、4、6、8、10、15和26 g)對每只后爪刺激最多4 s的時間，從塑料網(wǎng)下面插入，垂直地刺向其雙側(cè)后肢足底中部皮膚，緩慢增加刺激壓力，直到VFH纖維絲剛剛彎曲。治療前后對正常大鼠進行測量，試驗包括在每只后爪上進行5次重復的VFH測試(頻率為每1 ～ 1.5/次)，刺激5次出現(xiàn)3次縮足，則此纖維絲的刺激強度即為有效強度；反之，則為無效強度。當某一刺激強度的纖維對于實驗動物為有效強度時，則選用低一級刺激強度的von Frey絲進行刺激，直至出現(xiàn)無效強度，那么最小的有效強度則為該肢體的刺激反應閾值(Mechanical withdrawal threshold，MWT)[10,12,14,18,20,22,25-27]。

2.2 機械痛覺過敏測定

2.2.1 蘭德爾足壓試驗(Randall-Selitto)

使用Ugo Basile鎮(zhèn)痛儀對大鼠后足施加壓力壓力，用于量化傷害性閾值的參數(shù)是大鼠發(fā)出痛苦叫聲。進行實驗，直到得到兩個相似的連續(xù)壓力值。切斷壓力為450 g[10,14]。

2.2.2 4 g和15 g Von Frey纖維絲

將大鼠被放置在金屬篩網(wǎng)上(20 cm × 17 cm × 13 cm)，使用4 g或15 g的Von Frey 纖維絲，垂直地刺向其雙側(cè)后肢足底中部皮膚，緩慢增加刺激壓力，(每只后爪5次，即每只大鼠10次)，(頻率為每次1 ～ 1.5 s)，每次試驗3 min，間隔每只3～ 5 s，計算對刺激的戒斷反應次數(shù)，后足底撤退頻率測定 [即(足底撤退次數(shù)/5)×100]。用4 g Von Frey纖維絲引起幾乎不痛的刺痛感覺，正常大鼠很少對刺激產(chǎn)生反應，15 g Von Frey纖維絲刺激大約20%會引起戒斷反射，因此對4 g或15 g Von Frey 纖維絲刺激的反應表現(xiàn)為機械痛覺過敏[18-19,29]。

2.3 冷痛覺過敏測定(冷痛閾測定)

2.3.1 冷水浴鼠尾撤尾法

將大鼠的鼠尾浸入法在(4℃ 或 10℃)溫度下的水浴中進行，老鼠的尾巴浸泡水中，直到尾巴被取出來，記錄尾部浸泡時間，每隔5 min進行3 ～ 5次測量，記錄平均值，切斷時間為15 s。治療前對正常大鼠進行的測量作為正常參考值[10,12,14,16,24]。

2.3.2 冷板試驗測定

每只大鼠被放置在一個透明的塑料盒子(20 cm× 17 cm × 13 cm)中，上面有一個鐵絲網(wǎng)，使其適應環(huán)境后，用保持在8℃的截形鋁錐的尖端與老鼠的后爪子接觸，直至大鼠拔出后足，觀察大鼠的后足撤退時間，10次試驗(左右足各5次試驗)，每隔1 min進行一次，切斷時間為15 s，以避免對爪子造成傷害[15]。

2.3.3 丙酮試驗測定

(1)大鼠置于金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機玻璃罩(23 cm × 17 cm× 13 cm)，測試前先使大鼠適應環(huán)境15 min，待梳理探究活動消失后，將一滴(0.05 ml)丙酮放在足底后爪中央，根據(jù)反應給予4分制評分：0分=無反應；1分=快速拔出后足；2分=長時間退縮；3分=反復拍打后組或天后足內(nèi)側(cè)。對每只大鼠兩足使用丙酮分別檢測3次，得到累積分數(shù)，最低得分為0，最高得分為18分[18]。

(2)將50 μL丙酮用微噴霧器3次噴在每只后爪的足底皮膚上，以開始噴灑時為0時，計時40 s，統(tǒng)計大鼠40 s內(nèi)縮足次數(shù)。左右各3次， 共計6次[27][28]。

2.3.4 全自動智能冷板儀(北京眾實迪創(chuàng)科技有限公司)

將冷板儀溫度設置在4℃，待溫度恒定后，將大鼠置于冷板儀上，蓋以有機玻璃罩。讓其先適應1 min。計數(shù)60 s，觀察大鼠60 s內(nèi)反應，其中出現(xiàn)輕微躲避反應如抬足、添足、后退等計1分，強烈的躲避反應如跳起來計2分，無任何反應計0分。統(tǒng)計每只大鼠60 s內(nèi)總分數(shù)[30]。

2.4 熱痛覺過敏測定(熱痛閾測定)

2.4.1 熱輻射鼠后足法

將大鼠置3 min厚的玻璃板上的有機玻璃箱內(nèi)， 適應環(huán)境15 min，熱輻射儀照射大鼠后肢足底中部皮膚， 同時開始計時，當出現(xiàn)抬足、舔足，逃避等反應時讀輻射儀上的時間。調(diào)節(jié)照射光源強度，使正常大鼠潛伏期維持在10 ～ 20 s之間；設置自動切斷時間為30 s，防止燒傷大鼠皮膚。大鼠雙足分別連續(xù)測量5次，每次間隔5 s，去除最大和最小值后計算平均值，即為大鼠的熱痛閾值。正常大鼠在任何治療前的測量作為對照[12]。

2.4.2 熱輻射鼠尾法

使用輻射熱測痛儀UgoBasil (意大利米蘭)的甩尾試驗和設備測量大鼠的熱傷害性閾值。測痛儀由24 V，25 W 聚光燈泡制成，光線經(jīng)外罩上的聚光漏斗集中照射于鼠尾，漏斗外口直徑為3 mm，測痛時外口緊貼鼠尾，當鼠尾產(chǎn)生突然抽搐時，即為甩尾反應陽性，傳感器會檢測到它，借助秒表記錄甩尾反應潛伏時間(以下簡稱痛閾)，秒表記錄最低限度為0.1 s。取尾尖部起始的2 cm處測痛，反復測痛3次，記錄平均值[25,31]。

2.4.3 熱水浴鼠尾浸泡試驗

大鼠的鼠尾浸入法在較高(42℃或46℃)溫度下的水浴中進行，大鼠的尾巴被浸泡在水中，直到尾巴被取出來，記錄尾部浸泡時間，每隔5 min進行3 ～ 5次測量，記錄平均值，切斷時間為15 s。治療前對正常大鼠進行的測量作為正常參考值[10,14,24]。

2.5 運動協(xié)調(diào)性的測試

使大鼠在加速Rta-Rod跑步機(UgoBasile，Stoelting)上進行試驗。恒定速度(3.75 r/min)，將大鼠單獨放置在該裝置上，然后棒加速至37.5 r/min，記錄大鼠在旋轉(zhuǎn)桿上掉下來的時間，截斷時間定為5 min[12]。

3 大鼠CIPN模型在中醫(yī)科研中的應用

大鼠CIPN模型用于中醫(yī)治療奧沙利鉑誘導的神經(jīng)損傷，其機制的研究也具有重要意義。如蔡青等[32]研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可拮抗奧沙利鉑化療大鼠引起的熱痛閾值和體重減輕。天佛參能抑制奧沙利鉑神經(jīng)毒性模型大鼠的體重減輕，有效地抑制奧沙利鉑誘發(fā)的末梢疼痛覺過敏癥狀，提高MWT值，誘導μ、κ阿片受體表達升高[33]。雙筋龍湯可減輕化療致大鼠周圍神經(jīng)毒性,其機制可能是通過上調(diào)大鼠L4-L5后根神經(jīng)節(jié)中NGF的表達來介導的[34]。

多個學者研究表現(xiàn)黃芪桂枝五物湯對奧沙利鉑化療后誘導的神經(jīng)損傷大鼠有明確防治的療效，其治療機理可能與奧沙利鉑導致的背根神經(jīng)節(jié)核仁變化的改善、通過下調(diào)鈉離子通道亞型Nav1.7蛋白及基因表達量的增加相關[35]，還可能與降低血清、脊髓中丙二醛的含量來起到抗氧化作用從而保護周圍神經(jīng)元細胞，來達到減輕疼痛過敏及背根神經(jīng)節(jié)的氧化應激反應[36]。在神經(jīng)保護方面，黃芪桂枝五物湯還被證實可以改善大鼠病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的病變[37]，并對髓鞘變性有確實的保護作用，提高坐骨神經(jīng)傳導速度，縮短病變持續(xù)時間[38]，其機制可能是通過下調(diào)大鼠L4-L5脊髓中NR2B的表達以及上調(diào)DRG中pNF-H蛋白水平來介導[39]。

一些中藥成分的提取物也證實對此病的防治的療效及探討相關機理。成薇婷等[40]研究表明在奧沙利鉑圍化療期大鼠注射丹參酮ⅡA 能提高坐骨神經(jīng)傳導速度，縮短病變持續(xù)時間，發(fā)揮保護外周神經(jīng)的作用。黃芩苷能顯著提高熱刺激縮足閾值，對于奧沙利鉑導致的熱痛覺過敏具有顯著的抑制作用，其作用機制可能與抑制脊髓部位的nNOS 合成有關[41]。絞股藍皂苷可改善奧沙利鉑所致大鼠周圍神經(jīng)毒性溫度和機械刺激下的行為學改變，其機制與上調(diào)NGF水平以及Nrf2信號通路有關[42]。人參皂苷Rg3對大鼠奧沙利鉑神經(jīng)毒性具有一定的保護作用，可增加NGF的表達，減少DRG神經(jīng)元細胞的凋亡[43]。

溫經(jīng)通絡散外用治療能夠明顯緩解周圍神經(jīng)毒疼痛，加快坐骨神經(jīng)傳導速度，能有效降低奧沙利鉑對坐骨神經(jīng)的損傷，其治療作用可能是通過保護神經(jīng)元細胞，緩解坐骨神經(jīng)損傷，增加血清神經(jīng)因子表達，減少足底皮膚P物質(zhì)表達實現(xiàn)的[44]，也可能與抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細胞活化進而介導的傷害性信號傳遞有關[45]加快坐骨神經(jīng)傳導速度降低對坐骨神經(jīng)的損傷[46]及提高尾神經(jīng)SNCV以及NGF水平[47]，維持背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)興奮性氛基酸轉(zhuǎn)運體水平進而抑制背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的調(diào)亡、抑制脊髓背角星形膠質(zhì)細胞活化、及機械性痛覺及冷溫度刺激過敏反應有關[48]。見表4。

4 討論

大鼠CIPN模型造模和檢測簡單方便，可重復性好等優(yōu)點成為了國內(nèi)外研究者常用的模型，具有十分廣闊的發(fā)展前景，是腫瘤疼痛研究的重要手段和平臺，實驗研究中可以根據(jù)模型的特點以及本身治療手段特點和實際需要選擇適當動物模型，對于研究結(jié)果的可靠性具有重要意義。

表4 大鼠CIPN模型在中醫(yī)中應用Table 4 Rat CIPN model applied in Chinese medicine

西藥對于奧沙利鉑誘導的CIPN沒有明確的預防藥物，治療藥物為抗抑郁藥如度洛西汀及止疼類藥物[48]，療效不佳及副反應較大，中醫(yī)憑借獨特的治療優(yōu)勢辨證論治理論體系，在奧沙利鉑化療后誘導神經(jīng)病理性疼痛(CIPN)的治療方面取得了顯著療效，為此需要更精準的動物模型和更為有效的檢測方法來深入研究和探索具體作用機制及治療機理。但目前沒有中醫(yī)相關大鼠CIPN模型的造模體系，如何將大鼠模型和奧沙所致CIPN中醫(yī)辨證相關的“虛”“寒”“淤”分型相結(jié)合，建立中醫(yī)的相關動物模型，與中醫(yī)理論相結(jié)合，對于中醫(yī)科研探索此病的治療機制更有指導意義，進一步完善和建立中醫(yī)大鼠CIPN模型標準是日待解決問題。發(fā)揮中醫(yī)治療此病有獨特優(yōu)勢，才能在國際發(fā)病更有影響力的文章。