王翠香 劉春浩 于夢娟 王 靜 尹曉琳，*

(1.石家莊理工職業(yè)學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050000)

0 引言

百草枯(paraquat，PQ)是一種有效且廣泛使用的除草劑。但是，PQ中毒是一種非常嚴(yán)重的臨床疾病，致死率高，目前缺乏特效PQ解毒藥物[1]。一般來說，人類攝入PQ超過20mg/kg，就會導(dǎo)致死亡。短時間大量攝入PQ，快速導(dǎo)致多器官衰竭和休克，進(jìn)而死亡。小劑量PQ攝入會在肺部累積，產(chǎn)生大量致肺部損傷的氧自由基，最終導(dǎo)致肺纖維化，而后死亡[2]。

香附，中藥名，莎草科植物莎草的根莖，具有疏肝解郁、理氣寬中、止痛調(diào)經(jīng)的作用，相關(guān)研究表明此藥還具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用。本實(shí)驗(yàn)擬將香附作用于百草枯中毒的肺上皮細(xì)胞株A549，通過檢測對A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子TNF-α、TGF-β的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)的影響情況，初步探討香附是否對PQ作用下的A549細(xì)胞損傷抑制作用，為尋找治療百草枯中毒的中草藥提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥品

A549細(xì)胞株(河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室保存)香附，中藥店購買，本室制成水煎液備用[3]；百草枯(PQ)，山東三元工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；兔抗人NADPH、p65抗體購自CST公司；CCK-8檢測試劑盒日本同仁化學(xué)產(chǎn)品；TNF-α、TGF-β ELISA試劑盒為Raybiotech公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8法檢測 A549細(xì)胞的增殖

A549細(xì)胞用10%FBS 1640RPMI培養(yǎng)基于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代。收獲細(xì)胞后，以5×103/孔的濃度接種96孔板，每孔100μl細(xì)胞懸液，加入不同濃度的PQ和香附提取液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸棄上清，每孔加入含10μl CCK-8試劑的培養(yǎng)基100μL，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)再次孵育1.5h。

1.2.2 western-blot法檢測A549細(xì)胞NF-κB P65的表達(dá)

將A549細(xì)胞以3.75×105/2mL/孔的濃度接種于6孔板，培養(yǎng)24h，加入不同濃度的PQ和香附提取液，于30min、1h、2h收集細(xì)胞，western-blot法檢測NF-κB P65的表達(dá)。

1.2.3 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、TGF-β、FN的表達(dá)

將A549細(xì)胞以5×104/1mL/孔的濃度接種于12孔板，加入含有不同濃度PQ和香附提取液的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后，吸取上清。用ELISA方法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、纖連蛋白(FN)的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 香附水提液對百草枯作用的A549細(xì)胞增殖的影響

為評估PQ的細(xì)胞毒性，我們用不同濃度的PQ(0～1.0mM)作用于A549細(xì)胞24h,用CCK-8試劑檢測A549細(xì)胞的增殖情況，見圖1A，從PQ0.2mM開始，細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡現(xiàn)象。因此，我們選擇0.3mM的PQ濃度作為PQ誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的試驗(yàn)濃度，評價香附對PQ對A549細(xì)胞死亡的影響。另外，評價不同濃度的香附(0～8mg/mL)對A549細(xì)胞有無毒性。結(jié)果見圖1B，不同濃度的香附對A549細(xì)胞的增殖無明顯影響。但對PQ對A549細(xì)胞的毒性有一定的調(diào)節(jié)作用，見圖1C，與對照組相比不同濃度的香附水提取液對百草枯所致的細(xì)胞損傷均有一定的保護(hù)作用，但各濃度間無顯著差異。

2.2 香附水提液對PQ中毒的A549細(xì)胞NF-κB-P65表達(dá)的影響

經(jīng)過試驗(yàn)，我們評價了香附及PQ對A549細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-ΚB-P65表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，0.3mM的PQ作用于A549細(xì)胞后，NF-ΚB-P65表達(dá)在不同時間段變化不明顯，但在2h時稍有降低。1mg/mL的香附作用于加入PQ的A549細(xì)胞后NF-ΚB-P65表達(dá)也無明顯改變，見圖2。

Western Blot結(jié)果顯示，PQ作用于A549細(xì)胞0.5h、1h、2h后P65蛋白的表達(dá)與對照組相比明顯增高，但各時間段之間比較無明顯差異，2h的表達(dá)稍有減少。而加入香附后，在1h的時候，P65的表達(dá)量比單獨(dú)PQ作用表達(dá)量減少，2h表達(dá)量不明顯。

(a)不同PQ濃度對A549細(xì)胞增殖的影響 (b)不同香附濃度對A549細(xì)胞增殖的影響 (c)香附對A549細(xì)胞PQ中毒的調(diào)節(jié)作用

PQ：百草枯；X：香附，數(shù)字代表香附的含量(mg/mL)

圖1 PQ和香附對A549細(xì)胞的增殖的影響

圖2 香附對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用 PQ：百草枯；CR：香附

2.3 香附水提液對PQ中毒的A549細(xì)胞TNF-α、TGF-β表達(dá)的影響

用ELISA方法檢測A549細(xì)胞經(jīng)PQ和香附作用24h上清中TNF-α和TGF-β的表達(dá)水平。結(jié)果顯示香附能促進(jìn)PQ0.3mM作用的A549細(xì)胞 TNF-α的表達(dá)，見圖3，TGF-β未檢測出來。

圖3 香附對PQ中毒的A549細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的影響

3 討論

百草枯是農(nóng)藥中常見的除草劑,但對人是高毒性的藥物,尤其是對肺的損傷更為嚴(yán)重,低劑量即可導(dǎo)致死亡。

A549是人的肺上皮細(xì)胞株，廣泛用于肺損傷和肺纖維化研究的細(xì)胞模型[4-5]。本研究首先用不同濃度的百草枯和香附分別作用于A549細(xì)胞，PQ在0.3mM開始至1mM濃度以濃度依賴方式引起細(xì)胞死亡，而香附在所使用濃度范圍內(nèi)(1～8mg/mL)對A549細(xì)胞內(nèi)均無致死毒性。其次，再以0.3mM的PQ濃度作為A549細(xì)胞的中毒濃度，再與不同濃度的香附共同作用于A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同濃度的香附均能緩解PQ對A549細(xì)胞的致死作用。因此，可以認(rèn)為香附提取液能有效緩解低劑量的PQ對A549細(xì)胞的致死作用，并可通過調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞來延緩肺纖維化，這給我們的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了證據(jù)[5]。

NF-κB這一轉(zhuǎn)錄因子參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多種生物進(jìn)程[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，其在百草枯導(dǎo)致肺纖維化的過程中也起著重要的調(diào)控作用[8]。NF-κB是氧化應(yīng)激敏感型轉(zhuǎn)錄因子，它在靜息狀態(tài)下不具有生物活性，百草枯中毒后產(chǎn)生大量的自由基、大量炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子。這些物質(zhì)可直接激活或間接活化 NF-κB。被激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核增強(qiáng)促纖維化細(xì)胞因子基因的表達(dá)，使α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維數(shù)量增多，進(jìn)而發(fā)揮促肺纖維化的作用。因此，實(shí)驗(yàn)用香附作用于PQ中毒的A549細(xì)胞，檢測NF-κB-p65的表達(dá)。但結(jié)果顯示NF-κB-p65在2h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的表達(dá)變化。推測原因，一是作用時間較短。二是香附?jīng)]有對該轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用，有待于進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

研究證明PQ引起染毒人和動物肺纖維化的重要機(jī)制之一是炎癥反應(yīng)學(xué)說。其中TNF-α、TGF-β在PQ感染時，經(jīng)NF-κB激活后產(chǎn)生，促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化、增殖和成熟分化，刺激其合成大量膠原蛋白，導(dǎo)致肺纖維化形成。因此，本實(shí)驗(yàn)中檢測了香附對PQ中毒的A549細(xì)胞2種細(xì)胞因子作用的影響，發(fā)現(xiàn)香附能促進(jìn)A549細(xì)胞TNF-α的分泌，而對TGF-β的產(chǎn)生無影響。本結(jié)果與文獻(xiàn)中動物試驗(yàn)結(jié)果不同[5]，其原因可能是在人體或動物體內(nèi)TNF-α的產(chǎn)生來源不完全是肺上皮細(xì)胞，還有巨噬細(xì)胞等其他細(xì)胞，或者香附在體內(nèi)的調(diào)節(jié)作用也不只是一種細(xì)胞，這有待于進(jìn)一步研究。

總之，本研究證明了PQ可直接造成非上皮細(xì)胞的損傷，香附具有緩解PQ對細(xì)胞的毒性作用，但其機(jī)制還需要進(jìn)行更深入的研究加以證實(shí)。