劉宏媛，李春旭，張錦濤，韓曉東，王津穎

（天津津酒集團(tuán)有限公司，天津 300130）

在濃香型大曲酒的生產(chǎn)中，發(fā)酵窖池窖齡越長，產(chǎn)酒的酒質(zhì)就越好，這是由于老窖中富含多種厭氧功能菌，它們參與濃香型白酒的生香過程[1]。濃香型白酒的主體香氣成分是己酸乙酯，而己酸乙酯是靠己酸菌產(chǎn)己酸與乙醇作用而產(chǎn)生的，由此可見，窖泥中的己酸菌是生成己酸乙酯的主要來源，與出酒的品質(zhì)有著緊密的聯(lián)系[1，5]。為此，本實(shí)驗(yàn)對津酒老窖泥中的己酸菌進(jìn)行分離純化，并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為人工老窖泥的培育提供支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

材料：窖泥（采自天津津酒集團(tuán)老窖池）。

試劑：乙酸鈉、硫酸銨、酵母膏、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、蛋白胨、乙醇、混合內(nèi)標(biāo)液（2%叔戊醇，2%醋酸正戊醇，2%2-乙基正丁酸）等。

1.2 儀器與設(shè)備

手提式滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、FID 檢測器，CDMC色譜工作站等。

1.3 培養(yǎng)基的制備

改良巴氏培養(yǎng)基[1]：乙醇20 mL(滅菌后，接種前添加)；硫酸銨0.5 g；乙酸鈉5 g；磷酸氫二鉀0.4 g；硫酸鎂0.2 g；酵母膏1 g；碳酸鈣10 g(滅菌后，接種前添加)；蛋白胨4 g；水1000 mL。

斜面的制作[2，5]：配制液體培養(yǎng)基，加瓊脂3%～4%，加熱融化后分裝于各試管內(nèi)，不超過試管高的1/5，加塞包扎后于0.1 MPa 滅菌30 min，置于無菌室冷卻至約60 ℃，加入2%的酒精，趁熱擺放斜面，待其凝固后置于真空干燥器中，抽真空至0.08 MPa，34 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，以檢查滅菌是否徹底，如斜面有雜菌加以剔除。

1.4 己酸菌的分離純化

1.4.1 種子液的制備[2-3]

稱取1 g 優(yōu)質(zhì)老窖泥，加入液體培養(yǎng)基內(nèi)，80 ℃水浴10 min，待冷卻至30～40 ℃，于無菌條件下加入乙醇2～3 滴，加塞包扎，放置于真空干燥器內(nèi)，抽真空至0.08 MPa，34 ℃培養(yǎng)7～10 d。

1.4.2 富集培養(yǎng)[3-4]

挑取產(chǎn)氣較早、較多且氣泡較大的試管，80 ℃水浴10 min，待冷卻后按照15%的接種量接于裝有液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)條件參照1.4.1培養(yǎng)5 d。

1.4.3 平板分離

挑取產(chǎn)氣多、氣泡較大的試管，于80 ℃水浴10 min。在無菌的條件下，用一支1 mL 無菌吸管吸取己酸菌液1 mL，加入盛有9 mL 無菌水的試管中充分混勻，然后用無菌吸管從該試管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL 無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1～10-6不同稀釋度的己酸菌液。取10-3～10-6濃度的菌液各1 mL，加入空培養(yǎng)皿中，倒入融化保溫的固體培養(yǎng)基，手掌平托培養(yǎng)皿緩慢搖晃幾圈，以使菌液與培養(yǎng)基混合均勻。待培養(yǎng)皿凝固后，培養(yǎng)條件參照1.4.1，培養(yǎng)3 d。

斜面轉(zhuǎn)接：無菌條件下，挑選形態(tài)規(guī)則的菌落轉(zhuǎn)接于試管斜面，培養(yǎng)條件參照1.4.1，培養(yǎng)3～5 d。

1.4.4 初篩

斜面試管抽真空培養(yǎng)3～5 d 后，有菌落長出，用滅菌后的接種針挑取少許菌落，置于滴有無菌水的載玻片上，于顯微鏡下觀察，從中挑取游動活潑、長短桿狀，最好是呈鼓錘狀芽孢的菌株作為初篩菌株。

1.4.5 己酸定性檢測

硫酸銅顯色法：發(fā)酵液1 mL，置于試管中，加入乙醚0.5 mL，再加入2%硫酸銅溶液1 mL，充分搖動混勻，放置分層后，在兩層中間呈藍(lán)色即證明有己酸的存在，顏色越深，己酸的含量越高。

1.4.6 己酸菌培養(yǎng)液中己酸含量的檢測

直接進(jìn)樣毛細(xì)管柱氣相色譜法：分析白酒采用混合內(nèi)標(biāo)（2%叔戊醇，2%醋酸正戊醇，2%2-乙基正丁酸）來測定己酸菌液中的有機(jī)酸。

1.4.6.1 儀器及條件

FID檢測器，CDMC色譜工作站。

色譜柱為毛細(xì)管柱PEG-20M，檢測器溫度250 ℃，汽化溫度220 ℃。

程序溫度：起始溫度50 ℃，恒溫2 min 后以3.5 ℃/min 速率升至200 ℃，繼續(xù)恒溫10 min，分流比40∶1。

1.4.6.2 樣品處理

取樣品50 mL，活性炭吸附，靜置，過濾，取清濾液20 mL 加鹽酸酸化至pH2，用無水乙醇稀釋至40 mL，搖勻；于10 mL 具塞試管中準(zhǔn)確移入10 mL處理后的樣品，加入0.1%三內(nèi)標(biāo)混合液（10 mL×0.1=10 μL）搖勻，進(jìn)樣量為1 μL。

1.5 己酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

選定酒精濃度（%vol）、pH 值、培養(yǎng)溫度(℃)和蛋白胨含量(g/L)4 個因素為影響己酸菌生長的主要因素，構(gòu)建4 因素4 水平的正交表，進(jìn)行正交試驗(yàn)。在試驗(yàn)過程中采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法對1 mL己酸菌液中的活菌數(shù)進(jìn)行計(jì)算，采用直接進(jìn)樣毛細(xì)管柱氣相色譜法對己酸菌液中己酸含量進(jìn)行檢測。因素水平表和正交試驗(yàn)表見表1、表2。

表1 培養(yǎng)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥中己酸菌的分離培養(yǎng)

對津酒窖泥中的己酸菌進(jìn)行分離純化，得到2株己酸菌，并命名為菌1、菌2，其菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)見表3。

2.2 己酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果

由硫酸銅顯色法的初步檢測可知，菌2 的己酸含量較高，因此選定菌2 為試驗(yàn)菌株；因素水平表參見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，試驗(yàn)結(jié)果分析見表4。

表2 試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 己酸菌的特征

由表4 可知，對于不同的指標(biāo)而言，不同因素的影響程度是不一樣的，不同指標(biāo)的優(yōu)選方案有所差別，通過綜合平衡法可以得到綜合的優(yōu)方案，具體平衡過程如下：

因素A：對于己酸菌數(shù)量和己酸含量都是取A4為最佳水平。

因素B：對于己酸菌數(shù)量和己酸含量都是取B2為最佳水平。

因素C：對于己酸菌數(shù)量和己酸含量都是取C1為最佳水平。

因素D：對于己酸菌數(shù)量取D4好，對于己酸含量取D3好，因?yàn)閷τ诩核岷浚蛩谼 為較重要因素，所以選取D3為最佳水平。

綜上分析可知，最優(yōu)方案為A4B2C1D3，即酒精濃度為3%vol、pH 值為6、培養(yǎng)溫度34 ℃、蛋白胨含量為4 g/L為己酸菌2的最適生長條件。

3 結(jié)論

3.1 己酸菌孢子有耐熱性，而營養(yǎng)細(xì)胞不耐熱，因此為了純化菌種，多采用熱處理的方法，本試驗(yàn)采用80 ℃水浴的方法取得了較好的效果。

表4 己酸菌數(shù)量試驗(yàn)結(jié)果分析

3.2 己酸菌在偏酸性(pH6)的環(huán)境下生長旺盛；添加一定量的酒精(3%vol)即可起到選擇性培養(yǎng)的作用，亦可促進(jìn)己酸菌的生長；己酸菌在30～36 ℃均能生長，但在34 ℃時其生長最為旺盛；簡化巴氏培養(yǎng)基中添加蛋白胨為筆者一次偶然試驗(yàn)所得，加入少量的蛋白胨可促進(jìn)己酸菌的生長繁殖，這可能是因?yàn)榈鞍纂藸I養(yǎng)較為豐富，含有多種適宜己酸菌生長的成分。由于試驗(yàn)條件所限，并未對此進(jìn)行更深一步的探討。

表5 己酸含量試驗(yàn)結(jié)果分析

3.3 己酸菌在白酒中的應(yīng)用主要用于加快窖泥的老熟，從而提高出酒質(zhì)量。本試驗(yàn)從津酒的窖泥中分離純化出兩株己酸菌，采用硫酸銅顯色法對其己酸產(chǎn)量進(jìn)行粗測，采用直接進(jìn)樣毛細(xì)管柱氣相色譜法對己酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以為后續(xù)人工老窖泥的培育、己酸菌液在窖泥中的養(yǎng)護(hù)等研究提供基礎(chǔ)。