張子迪 李宜慧 朱彩霞 楊薇 白東清 李濤

摘要?[目的]對茶葉蛋白質(zhì)的最佳提取條件進(jìn)行研究，并研究茶葉蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性，為茶葉的高附加值利用提供思路。[方法]采用超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)，采用響應(yīng)面法進(jìn)行茶葉蛋白提取工藝的優(yōu)化。將茶葉蛋白采用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行水解，獲得具有抗氧化活性的茶葉多肽。[結(jié)果]?通過響應(yīng)面法得到茶葉蛋白的最佳理論提取條件：提取時間120?min，提取溫度59.02??℃，堿液濃度0.65?mol/L，料液比1∶20。在此條件下，預(yù)測得到的茶葉蛋白質(zhì)最大提取量為29.79%，經(jīng)過驗(yàn)證后，茶葉蛋白的最大提取量達(dá)到28.39%。利用風(fēng)味蛋白酶酶解茶葉蛋白獲得具有較強(qiáng)抗氧化能力的多肽混合物，酶解的最佳條件為：酶解時間?60?min，?酶解溫度60??℃，酶解pH?7.0，?酶用量?9%。[結(jié)論]該研究開發(fā)了一種茶葉蛋白的提取工藝，并且茶葉蛋白可以通過風(fēng)味蛋白酶酶解制備綠色、天然的抗氧化劑。

關(guān)鍵詞?茶;蛋白提取;抗氧化性;響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號?TS272.5+1文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）07-0202-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.058

Study?on?the?Extraction?of?Protein?from?Green?Tea?and?Preparation?of?Antioxidant?Peptides

ZHANG?Zidi，LI?Yihui，ZHU?Caixia?et?al

（College?of?Basic?Science，?Tianjin?Agricultural?University，?Tianjin?300384）

Abstract?[Objective]?To?study?the?optimum?extraction?conditions?of?protein?from?tea?and?investigate?the?antioxidant?property?of?the?enzymatic?hydrolysates?of?tea?protein，?so?as?to?provide?a?new?perspective?for?the?high?addedvalue?development?of?tea?protein.?[Method]?The?ultrasoundassisted?alkali?method?was?used?for?the?extraction?of?tea?protein，?and?the?extraction?process?was?also?optimized?through?the?response?surface?methodology.?The?antioxidant?tea?peptides?were?obtained?by?hydrolyzing?the?purified?tea?protein?with?flavor?protease.?[Result]The?predicated?optimum?conditions?for?the?extraction?of?tea?protein?were?as?follows：?extraction?time?of?120?min，?extraction?temperature?of?59.02??℃，?alkali?concentration?of?0.65?mol/L，?and?material/solvent?ratio?of?1∶20.?The?predicted?maximum?protein?extracted?yield?was?29.79%?under?these?conditions.?The?actual?yield?of?extracted?tea?protein?was?28.39%?after?verification?by?experiment.?The?peptides?which?were?obtained?by?hydrolyzing?the?tea?protein?using?flavourzyme?demonstrated?good?antioxidant?property.?The?optimum?enzymatic?hydrolysis?conditions?getting?from?single?factor?experiment?were：?the?reaction?time?of?60?min，?the?reaction?temperature?of?60?℃，?the?pH?value?of?7，?and?the?dosage?of?flavourzyme?of?9%.?[Conclusion]We?successfully?developed?a?new?extraction?method?for?the?tea?protein，?and?studied?the?antioxidant?property?of?the?enzymatic?hydrolysates?of?tea?protein.?The?results?showed?that?it?could?be?developed?to?a?kind?of?green?natural?antioxidant.

Key?words?Tea;Protein?extraction;Antioxidant;Response?surface?methodology

基金項(xiàng)目?天津市高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（200810061098）。

作者簡介?張子迪?（1998—），女，天津人，專業(yè)：生物制藥。通信作者，講師，博士，從事天然活性多肽方面的研究。

收稿日期?2019-12-29

茶為山茶科山茶屬常綠灌木或小喬木植物，主要分布于中國、印度、印度尼西亞、斯里蘭卡、肯尼亞等熱帶和亞熱帶地區(qū)。茶最早被人們認(rèn)知是因其藥用價(jià)值?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中有記載“神農(nóng)嘗百草，日遇七十二毒，得茶而解之”;同樣唐代陳藏器編寫的《本草拾遺》中也有“諸藥為各病之藥，茶為萬病之藥”的記載。

茶葉中成分復(fù)雜，其中有機(jī)化合物的比例最高，約450種，占茶葉鮮重的15%～21%。茶葉中的主要有機(jī)物為茶多酚（20%～35%）、蛋白質(zhì)（20%～30%）、多糖（20%～25%）、脂肪（約8%）、生物堿（2%～5%），有機(jī)酸（約3%）、維生素（0.6%～1.0%）等[1]。目前茶多酚的成分及功效研究的比較深入，主要是一系列含有2-苯基苯并吡喃結(jié)構(gòu)的類黃酮類物質(zhì)，是茶葉中的主要功能保健成分。研究表明茶多酚具有清除人體內(nèi)自由基[2]、抗炎[3]、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]、調(diào)血脂[6]、防治動脈粥樣硬化[7]方面都有明顯效果。

茶葉中的蛋白質(zhì)含量僅次于茶多酚的量，其蛋白質(zhì)組成為82.05%的谷蛋白和13.61%的醇溶蛋白[8-9]。除了具有營養(yǎng)品質(zhì)，這些茶葉蛋白質(zhì)還可以較強(qiáng)的清除氧自由基。大部分的茶葉蛋白易溶于堿不溶于水，是大部分茶葉蛋白質(zhì)所具備的特征[8-9]。堿液對蛋白質(zhì)的氫鍵很有破壞作用，并且蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)，在堿液中會發(fā)生解離，那么蛋白質(zhì)的表面就會具有相同的電荷，這樣蛋白質(zhì)分子的溶解就會增多，提取率也就提高了[10-11]。

蛋白質(zhì)在酶的作用下，能夠水解生成有抗氧化性的酶解產(chǎn)物，會產(chǎn)生多肽片段，這些多肽片段具有強(qiáng)抗氧化作用[12]，這是蛋白酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)抗氧化作用的主要原因。酶解蛋白制備抗氧化肽也是目前獲得此類抗氧化多肽的重要方法。筆者從茶葉綜合利用的角度出發(fā)，對茶葉中的蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行了茶葉蛋白酶法制備抗氧化肽的研究，以期為茶葉廢棄物的資源化利用提供理論參考。

1?材料與方法

1.1?茶葉蛋白提取的單因素試驗(yàn)?將市售的綠茶葉放入小型高速粉碎機(jī)中粉碎，過70目篩，制成茶葉粉，待用。

1.1.1?提取時間對茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響。

稱取茶葉粉1?g放入50?mL的離心管中，按照料液比為1∶40（m/V，g∶mL）加入0.5?mol/L?NaOH?溶液，并在2?000?r/min轉(zhuǎn)速下攪拌均勻分散，50??℃下超聲波輔助提取60、75、95和120?min。茶葉提取混合液離心10?min（10?000?r/min，4??℃）。將上清液稀釋到合適的倍數(shù)后，檢測蛋白質(zhì)的含量，計(jì)算提取的茶葉蛋白占茶葉干重的百分含量。

1.1.2?提取溫度對茶葉中蛋白質(zhì)提取率的影響。

稱取1?g茶葉粉，按照料液比為1∶40（m/V）加入0.5?mol/L?NaOH?溶液，混合均勻，分別在50、60、70和80??℃條件下進(jìn)行超聲波輔助提取茶葉蛋白質(zhì)，采用考馬斯亮藍(lán)G250法測定蛋白質(zhì)的含量，計(jì)算提取的茶葉蛋白占茶葉干重的百分含量。

1.1.3?堿液濃度對茶葉蛋白質(zhì)提取的影響。

稱取1?g茶葉粉，按照料液比為1∶40（m/V）分別加入0.15、0.30、0.50和0.70?mol/L?NaOH?溶液，在50??℃下超聲波輔助提取60?min，測量提取液中蛋白質(zhì)的含量，并計(jì)算提取的茶葉蛋白占茶葉干重的百分含量。

1.1.4?料液比對茶葉蛋白質(zhì)提取的影響。

稱取1?g茶葉粉，提取溫度為50??℃，提取時間為60?min，堿液濃度為0.5?mol/L，分別在料液比（m/V）為1∶20、1∶30、1∶40和1∶50條件下進(jìn)行超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)，測量提取液中蛋白質(zhì)的含量，計(jì)算提取的茶葉蛋白占茶葉干重的百分含量。

1.2?響應(yīng)面法優(yōu)化茶葉蛋白的提取工藝

根據(jù)超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時間、提取溫度、堿液濃度和料液比4個因素為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中的關(guān)鍵因素，以茶葉蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)。應(yīng)用Design-Expert8.05b軟件，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立茶葉蛋白質(zhì)提取率與設(shè)計(jì)因素的回歸模型，對超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)的提取率進(jìn)行預(yù)測分析;對模型進(jìn)行回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)，確定各因素對茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響規(guī)律，分析各因素間交互作用，繪制影響因素的響應(yīng)面圖，根據(jù)回歸模型確定茶葉蛋白的最佳提取工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3?茶葉蛋白質(zhì)的分離與純化

根據(jù)響應(yīng)面分析法優(yōu)化所得到的最佳提取條件，進(jìn)行茶葉蛋白質(zhì)的提取。蛋白提取液冷卻至室溫后，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，在10000?r/min條件下，離心10?min，收集上清液，并按提取液：無水乙醇（1∶5，V/V），的比例加入冰乙醇，放入4??℃的冰箱靜置1?h。然后將沉淀混合液在10?000?r/min條件下，離心10?min，離心完成后，棄去上清液，收集沉淀蛋白，并用0.1?mol/L、pH?7.4?的PBS溶液將沉淀蛋白進(jìn)行溶解，得到茶葉蛋白質(zhì)的粗提液。將茶葉粗蛋白采用葡聚糖凝膠Sephadex?G-25層析柱分離純化，流速為0.3?mL/min，洗脫液每管收集3?mL，并測量在280?nm處的吸光度值，繪制出洗脫曲線。將收集到的茶葉蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到茶葉蛋白粉。

1.4?茶葉蛋白的酶解及酶解產(chǎn)物抗氧化活性的檢測

1.4.1?酶解時間對茶葉蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

將純化后的茶葉蛋白用0.1?mol/L、pH?7.0的PBS?緩沖液溶解，按底物蛋白的10%的比例加入風(fēng)味蛋白酶，酶解溫度為60??℃，酶解時間分別為30、45、60和75?min。反應(yīng)結(jié)束后，采用連苯三酚自氧化法測定茶葉多肽的抗氧化活性，確定酶解時間對茶葉蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。

1.4.2?酶解溫度對茶葉蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。

將純化后的茶葉蛋白用0.1?mol/L、pH?7.0?的PBS緩沖液溶解，按照底物蛋白的10%的比例加入風(fēng)味蛋白酶，反應(yīng)時間為60?min，在40、50、60和70??℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，檢測酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，確定反應(yīng)溫度對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。

1.4.3?pH對茶葉蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。

將純化后的茶葉蛋白用不同pH的緩沖液進(jìn)行溶解（pH?5.7、6.5、7.0、7.5），按照底物蛋白的10%的比例加入風(fēng)味蛋白酶，反應(yīng)時間為60?min，檢測酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，?分析pH對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。

1.4.4?酶用量對茶葉蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。

將純化后的茶葉蛋白用0.1?mol/L、pH?7.0?的PBS緩沖液溶解，反應(yīng)時間為60?min，反應(yīng)溫度為60??℃，酶用量分別為底物蛋白的2%、4%、6%、8%和10%。酶解反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行產(chǎn)物抗氧化性的測定，分析酶用量對茶葉蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。

1.5?蛋白濃度的測定

根據(jù)BCA?蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）要求，將試劑A與試劑B以50∶1的比例配制成工作液。配制0.5?g/mL?標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20?μL加入96?孔平板中，加入蒸餾水稀釋至20?μL。各孔加入200?μL的BCA?工作液，37??℃放置30?min。用酶標(biāo)儀在562?nm波長下測定吸光度，然后以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度、吸光度分別對應(yīng)于橫、縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取20?μL樣品溶液加入BCA工作液200?μL，37??℃保溫30?min。在562?nm波長下測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

1.6?抗氧化活性的測定[13]

取3?mL的0.1?mol/L?Tris-HCl緩沖液（pH?8.0），在325?nm處進(jìn)行空白調(diào)零后，取2.95?mL的Tris-HCl溶液，加入50?μL?60?mmol/L的連苯三酚溶液，迅速顛覆式混合，倒入石英比色皿中，在325?nm處記錄反應(yīng)進(jìn)行30和300?s時的吸光度（A值），得△A=A300s-A30s，?記為△A0;取2.90?mL的Tris-HCl溶液，加入50?μL的上清液，再加入50?μL?60?mmol/L的連苯三酚溶液，迅速顛覆式混合，分別在30和300?s時測量在325?nm處的吸光度（A值），得△A=A300s-A30s?記作△A樣，則樣品對自由基的清除率按以下公式計(jì)算：清除率=（△A0-△A樣）/△A0×100%。

2?結(jié)果與分析

2.1?超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)

2.1.1?提取時間對超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖1可知，當(dāng)提取時間為60～95?min時，隨著時間的增長，蛋白質(zhì)提取率提高，而提取時間繼續(xù)延長（120?min），茶葉蛋白的提取量有小幅下降。提取時間為95?min時，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值15.03%，表明在提取時間為95?min時，大部分茶葉蛋白質(zhì)都已經(jīng)完全溶解于提取液中。

2.1.2?提取溫度對超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖2可知，

隨溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率提高，在60??℃時蛋白的提取量達(dá)到最大值（18.2%），隨著溫度的繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)提取率有所下降。由于蛋白質(zhì)在高溫的條件下容易變性，甚至降解[14]。為了降低高溫對茶葉蛋白質(zhì)的不利影響，并且節(jié)約能耗，選擇60?℃為最佳提取溫度。

2.1.3?堿液濃度對超聲波輔助堿法提取茶葉中蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖3可知，

隨著堿液濃度的增大，蛋白質(zhì)提取率提高，堿液濃度為0.5?mol/L?時，茶葉蛋白的提取量達(dá)到最大，隨著堿液濃度的增大，蛋白質(zhì)提取量有所下降。在堿液濃度為0.5?mol/L時，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大為16.27%，說明大部分茶葉蛋白質(zhì)在濃度為0.5?mol/L的堿液中被溶出。

2.1.4?料液比對超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)提取率的影響。由圖4可知，

當(dāng)料液比為1∶20～1∶40時，隨料液比的增大，蛋白質(zhì)提取率逐漸提高，而隨著料液比的繼續(xù)增大，蛋白質(zhì)提取率有少量下降。由于料液比太大，在提取后會造成廢水處理的負(fù)擔(dān)，并會使提取液中的蛋白質(zhì)濃度偏低，這樣會造成蛋白質(zhì)難以絮凝沉淀，所以在單因素條件下料液比以1∶30最佳。

2.2?響應(yīng)面分析法優(yōu)化茶葉蛋白提取工藝條件

2.2.1?響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

根據(jù)BoxBehnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取提取時間?（A）、提取溫度（B）、堿液濃度（C）和料液比（D）4個因素，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行優(yōu)化分析，試驗(yàn)因素和水平見表1。

2.2.2?響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。

選擇Box-Behnken中心組合試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共有29個試驗(yàn)點(diǎn)。試驗(yàn)點(diǎn)可以分為2類，一類是析因點(diǎn)，共有24個，是自變量的取值在4個因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn);另一類是區(qū)域的中心點(diǎn)，中心點(diǎn)試驗(yàn)需要重復(fù)5次，是為了估算試驗(yàn)誤差。最后的影響值是茶葉蛋白質(zhì)提取量。BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

利用Design-Expert?8.05b軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到蛋白質(zhì)提取率對以上4個因素的二次多項(xiàng)式回歸模型：?茶葉蛋白提取量=22.89-0.50A-2.17B+3.62C+3.06D+1.69AB+1.75AD+0.65BC-0.85BD+3.59CD+2.18A2-4.10B2-4.30C2-2.64D2。

對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。該回歸方程在描述4個因素和響應(yīng)值的關(guān)系時，二次多項(xiàng)回歸模型顯著，但各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。二次多項(xiàng)回歸模型的一次項(xiàng)C（堿液濃度）、D（料液比）極其顯著，B（提取溫度）顯著;二次項(xiàng)B2（提取溫度）、C2（堿液濃度）極其顯著;交互項(xiàng)CD顯著。根據(jù)二次多項(xiàng)式回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果，可以看出方程的失擬項(xiàng)較小，表明該方程對試驗(yàn)擬合情況好、誤差小，得到的二次多項(xiàng)回歸模型可以較好的分析和預(yù)測茶葉蛋白質(zhì)的提取率。

提取時間與提取溫度、提取時間與堿液濃度、提取時間與料液比之間的交互作用不顯著;堿液濃度和料液比之間交互作用較顯著，其響應(yīng)面交互作用情況如圖5所示。

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到的模型方程，預(yù)測提取的茶葉蛋白的最高量可以達(dá)到29.80%，達(dá)到該最高值的條件：提取時間120?min，提取溫度59.02??℃，堿液濃度0.65?mol/L，料液比1∶20。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法得出的茶葉蛋白質(zhì)提取率模型的合適性和有效性，需要在最佳條件下進(jìn)行三組驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際情況，提取溫度定為60??℃，提取時間為120?min，堿液濃度0.65?mol/L，料液比1∶20，得到蛋白質(zhì)提取率的試驗(yàn)平均值為28.39%，與模型預(yù)測值29.80%的差值僅占預(yù)測值的4.73%，這充分說明了該模型可以較好的分析和預(yù)測超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)的提取率。

2.3?茶葉蛋白質(zhì)的分離與純化

將提取所得蛋白溶于PBS溶液中，用葡萄糖凝膠Sephadex?G-25層析柱，進(jìn)行凝膠過濾層析法分離純化。根據(jù)圖6的蛋白質(zhì)的洗脫峰進(jìn)行收集洗脫液，收集第10管到38管間的洗脫液，合并并進(jìn)行冷凍干燥，從而得到純化了的綠茶蛋白質(zhì)粉末。

2.4?茶葉蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性分析

2.4.1?反應(yīng)時間對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。由圖7可知，

當(dāng)反應(yīng)時間?30～60?min時，隨著酶解反應(yīng)時間的增長，茶葉蛋白酶解產(chǎn)物自由基清除率不斷上升;當(dāng)反應(yīng)時間為60～75?min時，隨著反應(yīng)時間的增長，自由基清除率稍有下降。因此選定60?min為最適酶解反應(yīng)時間，自由基的清除率為?48.2%。

2.4.2?反應(yīng)溫度對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。由圖8可知，

當(dāng)酶解反應(yīng)溫度為40～60?℃時，隨著反應(yīng)溫度的升高，自由基清除率不斷上升，而反應(yīng)溫度在60～70?℃時，隨著反應(yīng)溫度的升高，超自由基清除率下降明顯，說明溫度升高，對風(fēng)味蛋白酶活性的影響很大。這是因?yàn)樵陲L(fēng)味蛋白酶酶解蛋白質(zhì)的過程中，反應(yīng)效率受溫度的影響主要表現(xiàn)在以下2個方面：一方面是對風(fēng)味蛋白酶催化反應(yīng)速率的影響，另一方面則是對風(fēng)味蛋白酶穩(wěn)定性的影響。在一定的范圍內(nèi)升高溫度，會使蛋白質(zhì)酶解的速度加快，即酶解效率被提高。但是當(dāng)溫度超過一定的限度，過高溫度會造成酶分子的變性，那么風(fēng)味蛋白酶的穩(wěn)定性會降低，這樣酶解的效率就會下降[15]。因此，選定60?℃為酶解反應(yīng)溫度。

2.4.3?pH對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。由圖9可知，當(dāng)酶解反應(yīng)體系的pH?為7.0時，茶葉蛋白酶解產(chǎn)物對自由基清除能力達(dá)到最高值（52.1%）。當(dāng)pH為7.5時，酶解產(chǎn)物的抗氧化能力最低，可能在弱堿性環(huán)境中，就會造成風(fēng)味蛋白酶分子的構(gòu)象的改變，造成酶解效率的降低。因此，選定pH?7.0為茶葉蛋白酶解制備抗氧化肽的反應(yīng)pH。

2.4.4?酶量對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響。由圖10可知，當(dāng)酶量為3%～9%時，隨著酶量的增大，茶葉蛋白酶解產(chǎn)物的自由基清除率不斷上升;當(dāng)酶量為9%～12%時，酶量的增加對超氧自由基清除率的影響基本保持不變?；诔杀痉矫娴目紤]，增加酶量，就意味著成本的增加。因此希望用酶量盡量少，同時保證得到的酶解產(chǎn)物較高的抗氧化能力，并發(fā)揮酶的最大催化作用，避免造成浪費(fèi)?[16]。由于酶量是底物蛋白質(zhì)的9%～12%時，呈現(xiàn)趨勢基本穩(wěn)定，考慮到成本問題，因此選定9%為最佳反應(yīng)酶量。

3?結(jié)論

通過對茶葉蛋白質(zhì)提取條件的研究，進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了茶葉蛋白質(zhì)的提取條件。?根據(jù)模型預(yù)測當(dāng)提取時間為120?min，提取溫度是59.02??℃，堿液濃度為0.65?mol/L，料液比為1∶20時，預(yù)測得到的茶葉蛋白最大提取產(chǎn)量為29.79%，而驗(yàn)證結(jié)果表明在此條件下蛋白質(zhì)提取率的試驗(yàn)平均值為28.39%，與模型預(yù)測值29.80%的差值僅占預(yù)測值的4.73%，充分說明了該模型可以較好的分析和預(yù)測超聲波輔助堿法提取茶葉蛋白質(zhì)的提取率。?造成偏差原因可能是實(shí)際提取試驗(yàn)中，超聲波提取裝置會在超聲過程中升溫，造成溫度的變化，溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響又很大，所以才會略有出入。提取的茶葉蛋白質(zhì)經(jīng)過風(fēng)味蛋白酶酶解后，酶解產(chǎn)物具有較高的超氧自由基清除率，該試驗(yàn)結(jié)果表示茶葉蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物有很好的抗氧化性，可以被應(yīng)用于食品產(chǎn)業(yè)，來開發(fā)一種新型、綠色、天然的抗氧化劑。

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