李 珠，孫武裝，閆曉婧

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是臨床常見的慢性進(jìn)展性呼吸系統(tǒng)病癥，以持續(xù)氣流受限為主要病理表現(xiàn)[1]。臨床普遍認(rèn)為，COPD發(fā)病與吸煙、職業(yè)性粉塵、化學(xué)物質(zhì)、空氣污染等有關(guān)[2]。近年來，COPD的發(fā)病率、病死率呈上升趨勢[3]。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage， AM)是一種廣泛存在于肺泡內(nèi)和支氣管表層的炎性細(xì)胞，在抗菌、免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)等方面起著重要作用，而AM過度釋放白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)等細(xì)胞因子是COPD肺組織損傷的關(guān)鍵[4]。當(dāng)前治療COPD主要為對癥治療或緩解氣道炎癥治療，但二者均不能有效改變肺功能漸進(jìn)性下降和氣道炎癥。近年抗細(xì)胞因子治療取得了較好效果。白藜蘆醇(Res)是一種主要存在于葡萄等水果中的多酚類化合物[5-7]。研究證實(shí)，Res有著良好的抗炎、抗菌、抗氧化及抑制細(xì)胞因子等作用[8-9]。巨噬細(xì)胞可分為M1型和M2型，M1型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，M2型巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)細(xì)胞因子的分泌，二者在COPD中的作用機(jī)制是目前臨床研究的重點(diǎn)。本文主要通過對比分析不同劑量Res干預(yù)對吸煙致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1及相關(guān)表面標(biāo)記物的影響，探討相關(guān)細(xì)胞因子及表面標(biāo)記物在COPD中的作用機(jī)制，以更好地指導(dǎo)臨床治療。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 75只SD新生大鼠及飼料購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK2018-0019；雌38只，雄37只；生長齡5.1～6.3(5.2±0.3)個月；體質(zhì)量250.8～260.4(254.3±5.6)g。SD大鼠由專人飼料喂養(yǎng)，相同喂養(yǎng)方法(自由飲食)，飼料和用水新鮮無污染。

1.2 研究方法

1.2.1 分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將所有SD新生大鼠分為研究A組、研究B組、研究C組及研究D組和對照組，每組各15只。研究A組：雌8只，雄7只；生長齡5.6～5.8(5.7±0.2)個月；體質(zhì)量255.9～258.0(256.7±20.3)g。研究B組：雌8只，雄7只；生長齡5.0～5.9(5.5±0.6)個月；體質(zhì)量256.3～259.8(256.2±31.2)g。研究C組：雌7只，雄8只；生長齡5.4～5.8(5.6±0.5)個月；體質(zhì)量255.3～257.5(256.2±26.7)g。研究D組：雌8只，雄7只；生長齡5.5～6.0(5.7±0.3)個月；體質(zhì)量256.0～258.2(257.2±18.4)g。對照組：雌7只，雄8只；生長齡5.3～5.9(5.5±0.1)個月；體質(zhì)量252.7～256.1(255.0±33.8)g。5組SD新生大鼠在雌雄比例、生長齡及體質(zhì)量等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本實(shí)驗(yàn)通過動物保護(hù)和使用委員會審查并獲得批準(zhǔn)開展。

1.2.2 造模：5組SD新生大鼠均進(jìn)行2周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，通過點(diǎn)燃香煙吸入煙霧的方式制作COPD模型。具體操作：備好1個規(guī)格為100 cm×80 cm×80 cm的密閉式熏箱，在每個側(cè)壁留制1個2.5 cm×2.5 cm的窗孔，然后把選取的大鼠放入箱內(nèi)；采用被動吸煙法：箱內(nèi)每次同時點(diǎn)燃4支香煙(江西中煙生產(chǎn)的金圣牌軟包裝香煙，焦油含量11 mg，煙堿量1.0 mg，煙氣一氧化碳量12 mg)，當(dāng)香煙燃燒完畢、煙霧消失后，開啟箱蓋5 min后繼續(xù)點(diǎn)燃4支香煙，循環(huán)進(jìn)行，點(diǎn)燃12支香煙后去除大鼠，清洗煙箱。每日2次，每次間隔6 h以上，持續(xù)6個月。6個月后手術(shù)取大鼠右肺上葉組織條，經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察病理切片發(fā)現(xiàn)支氣管纖毛呈倒伏，且杯狀細(xì)胞增生，分泌物增加，支氣管管壁下炎性細(xì)胞明顯增多，肺泡腔明顯擴(kuò)大，肺泡壁斷裂，肺泡融合，見顯著肺氣腫，同時肺泡間隔水腫增寬，成纖維細(xì)胞增生，小氣道平滑肌增殖紊亂，血管腔狹窄，即為COPD造模成功。5組大鼠均造模成功。

1.2.3 純化AM：各組均行AM純化。

1.2.3.1 肺泡灌洗液采集：使用95.0%乙醇浸泡3～5 min處死大鼠，剪開頸部皮膚，妥善分離氣管，再用絲線于環(huán)狀軟骨下妥善結(jié)扎。應(yīng)用7號小兒頭皮針置入氣管內(nèi)，用絲線固定。2 ml注射器抽RPMI 1640培養(yǎng)液1.2 ml，緩慢推入氣管(最好先回抽肺殘留氣體)，停留1 min后逐步回抽，得回收液約1 ml。將回收液注入帶塞離心管內(nèi)。上述操作重復(fù)10次。將取得的液體在2000 r/min條件下離心10 min后棄去上清液，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)控在1.5×106/ml。

1.2.3.2 AM純化：把上述得到的單細(xì)胞懸液2 ml、瓊脂培養(yǎng)液7 ml及大鼠血清1 ml加入到25 ml的培養(yǎng)瓶中，充分混勻后放入37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)持續(xù)孵育2.5 h，使AM貼壁。將非貼壁細(xì)胞去除后，加乙二胺四乙酸二鈉10 ml。30 min后回收貼壁細(xì)胞，2000 r/min離心10 min，應(yīng)用培養(yǎng)液洗滌3次，將細(xì)胞濃度調(diào)控在1.5×106/ml，即獲得純化后的AM液。

1.2.4 Res預(yù)處理

1.2.4.1 研究組：取研究A組、B組、C組及研究D組AM純化液，用傳代3次的AM細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，穩(wěn)定3 d，分別加入50、100、150、200 mol/L Res(杭州瑞樹生化有限公司生產(chǎn))預(yù)處理12 h。

1.2.4.2 對照組：取對照組AM純化液，用傳代3次的AM細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，穩(wěn)定3 d，不行Res預(yù)處理。

1.3 主要儀器設(shè)備 Trizol RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitro-den公司生產(chǎn))；NF-κB基因引物(上海生物工程公司合成)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測儀(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))；ChemiDoc XRS凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))；MR Ⅲ型酶標(biāo)儀(美國Hyperion公司生產(chǎn))。

1.4 觀察指標(biāo) 對比觀察5組SD大鼠Res不同時間(4、6、12 h)干預(yù)下細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1)和M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物CD11c、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物精氨酸酶1(Arg-1)、CD206)表達(dá)的水平。

1.4.1 IL-6、TNF-α、MMP-9及TIMP-1測定：于Res干預(yù)4、6、12 h時提取5組96孔板內(nèi)的待測AM純化液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測5組大鼠IL-6、TNF-α、MMP-9及TIMP-1水平。試劑盒購自美國R&D公司，采用Hyperion MR Ⅲ型酶標(biāo)儀測定。

1.4.2 巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物測定：于Res干預(yù)4、6、12 h時提取96孔板內(nèi)的待測AM純化液，用Trizol法提取AM貼壁細(xì)胞總RNA，以總RNA為模板將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)基因引物，用Real-time PCR SYB Green行熒光定量PCR檢查檢測基因表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參照，基因表達(dá)相對倍數(shù)變化用2-ΔΔCt計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠不同Res干預(yù)時間AM中IL-6水平比較 干預(yù)4、6 h時各組大鼠AM中IL-6含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，干預(yù)12 h時隨著Res干預(yù)劑量的增大AM中IL-6含量隨之降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著Res干預(yù)時間的延長5組大鼠AM中IL-6含量均升高，而且在干預(yù)12 h時達(dá)峰值，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 SD大鼠慢性阻塞性肺疾病5組不同劑量白藜蘆醇不同干預(yù)時間肺泡巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞介素6水平比較

注：研究A、B、C、D組分別為予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未予白藜蘆醇干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預(yù)4 h比較，aP<0.05，bP<0.01;與同組干預(yù)6 h比較，cP<0.05

2.2 5組大鼠不同Res干預(yù)時間AM中TNF-α水平比較 相同干預(yù)時間，AM中TNF-α水平對照組>研究A組>研究B組>研究C組>研究D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。對照組及研究A組、B組、C組、D組AM中TNF-α水平在干預(yù)4 h后逐步升高，到6 h時達(dá)峰值，隨后下降，干預(yù)12 h時除研究B、C、D組下降至干預(yù)4 h時水平，余組內(nèi)不同時間點(diǎn)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 5組SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同劑量白藜蘆醇不同干預(yù)時間肺泡巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子α水平比較

注：研究A、B、C、D組分別為給予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未給予白藜蘆醇干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預(yù)4 h比較，aP<0.05；與同組干預(yù)6 h比較，cP<0.05

2.3 5組大鼠不同Res干預(yù)時間AM中MMP-9比較 相同干預(yù)時間，AM中MMP-9水平對照組<研究A組<研究B組<研究C組<研究D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。對照組及研究A組、B組、C組、D組AM中MMP-9在干預(yù)4 h后逐步升高，到6 h時達(dá)峰值，隨后下降，組內(nèi)不同時間點(diǎn)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 5組SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同劑量白藜蘆醇不同干預(yù)時間肺泡巨噬細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9比較

注：研究A、B、C、D組分別為予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未予白藜蘆醇干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預(yù)4 h比較，aP<0.05，bP<0.01；與同組干預(yù)6 h比較，cP<0.05

2.4 5組大鼠不同Res干預(yù)時間AM中TIMP-1水平比較 相同干預(yù)時間，研究A組、B組、C組、D組均高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，但研究A組、B組、C組、D組間AM中TIMP-1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對照組及研究A組、B組、C組、D組AM中TIMP-1水平在干預(yù)4 h后逐步升高，干預(yù)6 h時達(dá)峰值，隨后下降，組內(nèi)不同時間點(diǎn)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 5組SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同劑量白藜蘆醇不同干預(yù)時間肺泡巨噬細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1水平比較

注：研究A、B、C、D組分別為予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未予白藜蘆醇干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預(yù)4 h比較，aP<0.05，bP<0.01;與同組干預(yù)6 h比較，cP<0.05

2.5 5組大鼠不同Res干預(yù)時間巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物水平比較 相同干預(yù)時間，隨著Res干預(yù)劑量的增加，CD11c、iNOS表達(dá)明顯減弱，Arg-1、CD206表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且同組內(nèi)隨著Res干預(yù)時間的延長CD11c、iNOS表達(dá)逐漸減弱，Arg-1、CD206表達(dá)逐漸增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

3 討論

吸煙是COPD一個主要的致病因素，在長期吸煙過程中，煙霧所含的有害顆粒、氧化物質(zhì)會對支氣管黏膜纖毛系統(tǒng)造成直接性損傷，引發(fā)支氣管痙攣，進(jìn)而導(dǎo)致呼吸道防御、自凈等功能減弱。煙霧刺激還會誘導(dǎo)活化中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞釋放多種蛋白酶，而且會抑制抗蛋白酶類物質(zhì)的生成，如此導(dǎo)致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，同時還會釋放大量的氧自由基、氧化產(chǎn)物破壞與降解大量細(xì)胞外基質(zhì)，致使彈性纖維斷裂，進(jìn)而造成肺組織逐步破壞而形成肺氣腫。此種炎性細(xì)胞與炎性因子網(wǎng)絡(luò)在煙霧的誘發(fā)下會產(chǎn)生相互作用，加快肺組織破壞及氣道重塑，進(jìn)而讓氣流阻塞呈進(jìn)展性變化，最終發(fā)展成COPD。

表5 5組SD慢性阻塞性肺疾病大鼠不同劑量白藜蘆醇不同干預(yù)時間肺泡巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物水平比較

注：研究A、B、C、D組分別為給予白藜蘆醇50、100、150、200 mol/L干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組，對照組為未給予白藜蘆醇干預(yù)的SD慢性阻塞性肺疾病模型大鼠組；與同組干預(yù)4 h比較，aP<0.05;與同組干預(yù)6 h比較，cP<0.05

炎性反應(yīng)是COPD主要病理改變，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞參與其的發(fā)生、發(fā)展。近年研究表明，AM活化可能是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要途徑[10]。AM活化后會產(chǎn)生TNF-α、MMP-9等多種活性介質(zhì)，引起炎性細(xì)胞聚集，并浸潤肺臟導(dǎo)致肺損傷。氧化/抗氧化失衡已被證實(shí)是COPD肺損傷的主要病理機(jī)制，提示氧化應(yīng)激和COPD的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。抗氧化劑能有效改善患者的肺功能，且可延緩肺功能損傷，提升患者生活質(zhì)量[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，Res對COPD大鼠有著良好的抗氧化作用，這可能和降低有絲分裂原活化蛋白激酶家族中的應(yīng)激蛋白p38、ERK及JNK磷酸化水平，進(jìn)而抑制炎性蛋白酶釋放有關(guān)[12]。具體而言，就是Res通過降低機(jī)體促炎因子水平、提升內(nèi)源性巰醇抗氧化物水平，進(jìn)而對COPD模型大鼠的肺組織產(chǎn)生良好的抗氧化、抗炎作用。還有研究證實(shí)，Res可有效抑制COPD大鼠氧分壓的降低，提升用力呼氣量/用力肺活量比值，減少肺泡灌洗液中細(xì)胞間黏附分子21含量，降低肺濕/干重比，進(jìn)而減輕肺組織損傷[13]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)Res對COPD患者外周血單核細(xì)胞DNA氧化損傷有著良好的體外修復(fù)作用，且對肺損傷有良好的保護(hù)作用[12]。

TNF-α是一種內(nèi)源性細(xì)胞因子，可激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等促炎因子釋放。臨床研究表明，TNF-α可通過本身致炎作用和活化其他炎性細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致氣道炎性反應(yīng)[14]。IL-6是誘導(dǎo)急性期炎性反應(yīng)，其可通過激活蛋白水解促進(jìn)肌肉分解代謝。同時，IL-6可活化NF-κB抑制肌纖維蛋白合成，導(dǎo)致COPD患者分解代謝增強(qiáng)，合成代謝減弱，進(jìn)而造成患者惡病質(zhì)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metallo proteinases, MMPs)重要成員，MMPs可促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤，致細(xì)胞外基質(zhì)分解，破壞血管內(nèi)皮、氣道上皮基底膜，使炎性細(xì)胞游出并聚集于靶細(xì)胞[15]。而TIMP-1是MMP-9重要的天然抑制劑，可特異性抑制MMP-9活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生和膠原合成，致膠原細(xì)胞于肺泡壁過度沉積。當(dāng)前研究表明，TIMP-1可反映氣道組織修復(fù)情況，是氣道重塑的一個重要標(biāo)志物[16]。MMP-9與TIMP-1保持一定的動態(tài)平衡，以便維持細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解平衡，而該機(jī)制一旦被打破則會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂，膠原沉積、氣道重塑形成[17]。本結(jié)果顯示：隨著Res干預(yù)時間的延長5組大鼠AM中IL-6含量均升高，且在干預(yù)12 h時達(dá)峰值，干預(yù)12 h時隨著干預(yù)劑量的增大AM中IL-6含量隨之降低；相同干預(yù)時間，AM中TNF-α水平對照組>研究A組>研究B組>研究C組>研究D組，MMP-9水平對照組<研究A組<研究B組<研究C組<研究D組，研究A組、B組、C組、D組AM中TIMP-1水平均高于對照組；對照組及研究A組、B組、C組、D組AM中TNF-α、MMP-9、TIMP-1水平在干預(yù)后4 h后逐步升高，6 h時達(dá)峰值，隨后下降?？梢哉J(rèn)為有效劑量的Res能控制上述細(xì)胞因子分泌，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果基本一致[18]。由此表明，Res對吸煙致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α、MMP-9、TIMP-1有著積極的影響。

巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典激活、發(fā)揮促炎作用的M1型和替代活化、發(fā)揮抗炎作用的M2型。M1型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，被稱為經(jīng)典型巨噬細(xì)胞，具有很強(qiáng)的殺死微生物特性，但這種特性容易引起組織破壞。M2型巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)白細(xì)胞介素1β、TNF-α、白細(xì)胞介素12和白細(xì)胞介素18等細(xì)胞因子的分泌。本結(jié)果顯示，相同干預(yù)時間，隨著Res干預(yù)劑量的增加，CD11c、iNOS表達(dá)明顯減弱，Arg-1、CD206表達(dá)明顯增強(qiáng)；且同組內(nèi)隨著Res干預(yù)時間的延長CD11c、iNOS表達(dá)逐漸減弱，Arg-1、CD206表達(dá)逐漸增強(qiáng)。提示Res的應(yīng)用有助于改善COPD模型大鼠病情。

綜上所述，Res對吸煙致COPD模型大鼠AM中IL-6、TNF-α有良好的抑制作用，并可促進(jìn)MMP-9、TIMP-1分泌，明顯減弱M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，加強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，有助于改善模型大鼠病情。