張 猛，陳 晹，劉 嬌，李葉晟，黃楊卿

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD) 是脂肪肝分類中的一種，主要是指在非酒精因素作用下所引起的肝臟實質(zhì)細胞脂肪變性和脂肪沉積病癥，是代謝綜合征在肝臟的具體表現(xiàn)，主要的病理改變是肝細胞內(nèi)因代謝障礙而異常堆積的甘油三酯(triglycerides，TG)和異常沉積的總膽固醇(total cholesterol，TCH)。近年來，由于飲食結(jié)構(gòu)和生活習慣等的變化，NAFLD在我國呈逐年上升趨勢，已經(jīng)逐漸成為發(fā)病率第一位的肝臟疾病[1-3]。NAFLD的發(fā)生發(fā)展是個體、環(huán)境和遺傳等多種因素共同作用的結(jié)果，涉及到多基因、多環(huán)節(jié)和多途徑，具體的發(fā)病機制較為復雜，至今尚未完全明確。在這些因素中，肝臟的脂質(zhì)代謝異常被認為是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs) 是一類位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜連接蛋白。在肝臟， SREBPs 有3種同型異構(gòu)體，而SREBP-1在3種同型異構(gòu)體中含量最高，甘油三酯(TG)的合成和代謝受SREBP-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]。SREBP-1與固醇反應(yīng)元件 (sterol response element，SRE) 結(jié)合后激活下游與脂質(zhì)合成有關(guān)的關(guān)鍵酶，如 FAS、ACC1、HMGCoA還原酶等，其中乙酰輔酶A羧化酶(acetyl coenzyme carboxylase, ACC)催化乙酰輔酶A形成丙二酰輔酶A，合成長鏈脂肪酸前體，脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)則是催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A、參與長鏈脂肪酸生成的內(nèi)源性蛋白酶[5]。 本實驗旨在通過建立非酒精性脂肪性肝病小鼠動物模型，分析其肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因SREBP-1、FAS和ACC水平變化，以探討非酒精性脂肪性肝病與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因異常表達之間的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 SPF級雄性C57BL/6J小鼠20只，4 周齡，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，保證小鼠能夠自由飲食，維持12 h晝夜交替光照，飼養(yǎng)溫度控制在(25±2)℃，濕度保持在(50±5)%。檢測總膽固醇試劑盒和甘油三酯試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)；多聚甲醛(上海化學試劑有限公司，中國)；TRIzol 試劑(Invitrogen 公司，美國) ?；A(chǔ)飼料、高脂飼料和飼養(yǎng)用墊料均購于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心?；A(chǔ)飼料配方主要為：碳水化合物60%，蛋白質(zhì) 22%， 粗纖維5.6%，脂肪2.4%，其他 10.0%；高糖、高脂飼料組成：基礎(chǔ)飼料 66.5%，蔗糖 10%，豬油 20%， 膽固醇 3.4%，膽酸鈉 0.1%。SW-CJ-IF型超凈工作臺(蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司，中國) ；Sigma3-16K 高速離心機(Sigma公司，美國) ；7800 型 PCR 反應(yīng)擴增儀 (ABI公司，美國) ；Lejca熒光顯微鏡(Lejca公司，德國)；722S分光光度儀(上海緊密科學儀器公司；中國)；LKB-NOVA型超薄切片機(LKB公司，瑞典)；LightCycler 480 分析儀(羅氏公司，美國)。

1.2 NALFD模型的制備 將20只C57BL/6J雄性小鼠隨機分為正常對照組和NAFLD模型組，每組10只。給予對照組小鼠基礎(chǔ)飼料，給予NAFLD模型組小鼠高糖、高脂飼料，小鼠自由進食，定期監(jiān)測小鼠體質(zhì)量。在喂養(yǎng)24 w末，處死小鼠并解剖，收集血清。獲取肝臟組織，取部分肝組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片，HE染色，于光學顯微鏡下觀察肝組織脂肪變性情況；其余的肝臟組織置于液氮中，用于提取總RNA。

1.3 檢測 用TRI reagent試劑盒，提取肝組織總RNA，加入DNA 酶活化，提取總RNA 2 μg，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用primer design 軟件設(shè)計引物, 由上海生物工程公司合成。內(nèi)參：18 S上游：5’GTAACCCGTTGAACCCCATT 3’，18 S下游：5’ CCATCCAATCGGTAGTAGCG 3’，擴增片段長度為151 bp；FAS上游：5’CGCTCGGCTCGATGGCTCAG3’，F(xiàn)AS下游：5’CCAGCACCACGGCATGCTCA3’，擴增片段長度為157 bp；SREBP-1上游： 5’ GTGAGGCGGCTCTGGAACAGA

C3’，SREBP-1下游：5’ ATAGGGGGCGTCAAACAGGCC3’，擴增片段長度為134 bp。ACC上游： 5’CCGTTGGCCAAAACTCTGGAGCTAA 3’，ACC下游：5’GAGCTGACGGAGGCTGGTGACA3’，擴增片段長度為149 bp。 使用LightCycler 480 分析儀進行cDNA 擴增反應(yīng)，95 ℃預變性5 min ，依次行95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s 和72 ℃延伸30 s，設(shè)定循環(huán)50 次。選擇18 S 作為內(nèi)參對照，各基因mRNA 水平以其與對照比值表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肝質(zhì)量的比較 在喂養(yǎng)24 w末，對照組小鼠肝質(zhì)量為(1.1±0.2)g，NAFLD組小鼠肝質(zhì)量為(1.6±0.3)g，兩組小鼠肝質(zhì)量差異有統(tǒng)計學意義(t=4.385,P<0.001)。

2.2 兩組肝組織病理學變化比較 對照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，細胞呈放射狀整齊排列，細胞核圓，位于中央，細胞胞質(zhì)豐富，核膜清晰，肝細胞無脂肪浸潤；在NAFLD模型組，肝細胞排列不整齊，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡狀，細胞核偏移(圖1)。

圖1 兩組小鼠肝組織病理學變化(HE，100×)

2.3 兩組小鼠血清TG和TCH水平比較 在實驗24 w末，對照組小鼠血TG水平為(0.28±0.06)mmol/L，TCH水平為(2.78±0.6)mmol/L，而NAFLD組小鼠血TG水平為(0.63±0.13)mmol/L，TCH水平為(7.23±0.7)mmol/L(TG: t=7.731,P<0.001；TCH: t=15.263,P<0.001)，差異顯著(圖2)。

圖2 兩組小鼠血清TG和TCH水平比較

2.4 兩組小鼠肝組織FAS 、SREBP-1和ACC mRNA水平比較 在實驗24 w末，NAFLD組小鼠肝組織FAS 和SREBP-1 mRNA水平分別為(3.9±1.1)和(1.8±0.7)，對照組則分別為【(1.0±0.3)和(1.0±0.4)，F(xiàn)AS:t= 6.231,P<0.001； SREBP-1:t= 2.431,P=0.035】，差異顯著(圖3)；NAFLD組小鼠肝組織ACC mRNA水平為(1.2±0.5)，與對照組【(1.0±0.4)，t= 0.765,P=0.462，圖3】比，無顯著差異。

圖3 兩組小鼠肝組織FAS 、SREBP-1和ACC mRNA水平比較

3 討論

流行病學研究表明，NAFLD已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，發(fā)病率為20%～30%，而在肥胖人群中，其發(fā)病率更高。目前認為, NAFLD 主要有三個階段, 即單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)和肝纖維化階段。更進一步地，可能會進展為肝硬化甚至是肝細胞癌[6-7]。目前，NAFLD的發(fā)病機制尚未完全清楚。因此，很多關(guān)于其發(fā)生機制的研究都基于動物實驗。常用的NAFLD的動物模型有營養(yǎng)失調(diào)性模型、藥物中毒模型、基因改良模型和復合性模型等[8]。本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立NAFLD模型，該模型的優(yōu)點是可形成肥胖、代謝綜合征等表現(xiàn)的與人類NAFLD發(fā)病機制最相似的經(jīng)典非酒精性脂肪性肝病，鏡下可見大細胞性脂肪變性、肝小葉炎癥、纖維化等病理改變[8，9]。在本研究中，經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)24周后，小鼠肝組織肝細胞排列不整齊，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，細胞胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡狀，細胞核不居中，出現(xiàn)NAFLD樣的病理改變。本研究中，與對照組相比，NAFLD小鼠血清TG和TCH水平顯著上升，與文獻報道一致[10，11]。

SREBP是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)節(jié)下游一系列靶基因來參與脂質(zhì)自穩(wěn)態(tài)的多個方面調(diào)節(jié)，被認為是調(diào)節(jié)細胞脂質(zhì)自穩(wěn)態(tài)的“樞紐”。目前，已經(jīng)在肝臟組織中發(fā)現(xiàn)有3 種SREBP：即SREBP-1( 包括SREBP -1a 和SREBP -1c)和SREBP -2。SREBP -1c構(gòu)成了體內(nèi)90%的SREBP-1，而TG的合成和代謝受SREBP -2的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，SREBP -2可特異性激活膽固醇代謝基因[12]。SREBP-1c 前體蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后與SREBP 裂解激活蛋白(SCAP)結(jié)合，并由其送到高爾基體，分別被位點1、位點2 蛋白酶依次加工，釋放氨基末端片段入核，與其靶基因啟動子的固醇調(diào)節(jié)元件或E盒結(jié)合，即為nSREBP-1c，此活性形式能夠調(diào)控與TG 合成相關(guān)的靶基因， 如ACC1、FAS、SCD1 等30 多個基因的轉(zhuǎn)錄過程，因此SREBP-1c被稱為“脂毒性的門衛(wèi)”[13]。機體通過SREBP精細調(diào)節(jié)著脂質(zhì)合成。當SREBP 過度表達時則可引起器官和循環(huán)系統(tǒng)中TG和TCH的增高，從而導致器官和外周的脂質(zhì)蓄積[14，15]。肝細胞中的膽固醇和脂肪酸合成是偶聯(lián)的，并且通過膽固醇生物合成途徑的通量是最大SREBP-1c表達和脂肪酸合成的高速率所必需的[16]。FAS是一種多功能復合酶，在合成脂肪酸方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，與體內(nèi)的脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[17]。FAS在小鼠肝臟組織中大量表達，特別是在肝細胞的細胞質(zhì)中。它的表達上升是對內(nèi)源性脂肪酸合成和細胞增殖的適應(yīng)。隨著脂類物質(zhì)攝入的增加，F(xiàn)AS的表達往往上調(diào)，F(xiàn)AS基因轉(zhuǎn)錄增加，導致其活性增強，并引起脂肪酸合成增多和增加，在肝細胞中異常沉積形成脂肪肝[18]。有研究表明，NAFLD大鼠肝臟的FAS水平顯著上調(diào)[19]。SREBP-1c、FAS和ACC是調(diào)節(jié)肝臟脂肪生成的關(guān)鍵基因。文獻[20]報道，沉默SREBP-1c的表達可降低脂肪肝的發(fā)生率，同時抑制FAS和ACC的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD小鼠肝臟組織FAS 和SREBP-1 mRNA水平均顯著上調(diào)，而NAFLD小鼠肝臟組織ACC水平與對照組小鼠無顯著差別。在未來，仍需要更進一步研究來探索在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中，肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因所扮演的角色。

本研究采取高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠肝臟組織FAS 和SREBP-1 mRNA水平均顯著上調(diào)，提示NAFLD小鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，為進一步研究NAFLD的發(fā)生發(fā)展機制奠定了基礎(chǔ)。