王兵兵，李志遠(yuǎn)，王心悅，韓小麗，剡根強＞，王 建，馮廣余

（1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000）

緩慢葡萄球菌（Staphy lococcus lentus）屬于微球菌科、葡萄球菌屬（Staphy lococcus）。在1976年該菌被Kloos等研究者命名為松鼠葡萄球菌緩慢亞種（Staphy lococcus sciuri subsp .lentus）[1]，直到1983年由Schleifer K H等研究者將其劃分為葡萄球菌屬的一個獨立的種，緩慢葡萄球菌（S.lentus）[2]。

緩慢葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase-negative staphy loco cci，CNS）[1]。CNS是人體皮膚正常菌群之一，以前認(rèn)為緩慢葡萄球菌不具有致病性，但越來越多的研究表明CNS可引起人類及多種動物發(fā)病，成為了不可忽視的致病菌，在人醫(yī)臨床上已成為醫(yī)院感染的重要致病菌。緩慢葡萄球菌是條件致病菌，特別對于新生幼兒或者患有嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病以及長期接受治療的病人等免疫力相對低下的人群更容易感，感染后如不能及時治療導(dǎo)致嚴(yán)重后果[3-6]。在動物上引起奶牛乳腺炎、小鼠角膜炎、尿道炎、肺炎等疾病[4,7,8]，目前未見蜂感染該菌的報道。

目前，國內(nèi)外科研人員對緩慢葡萄球菌的文獻報道較少，對其致病機理、感染時機、及臨床治療意義等尚不清楚[3]，被用來進行進一步研究的資料以及菌種資源也十分有限。本研究從死亡熊蜂幼蟲中分離鑒定一株緩慢葡萄球菌，并對其進行了藥敏試驗研究，以期為進一步探討該菌特性、對熊蜂人工飼養(yǎng)過程中的影響等提供相關(guān)資料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

熊蜂發(fā)病幼蟲；API鑒定系統(tǒng)細(xì)菌鑒定儀，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；革蘭氏染液，購買于珠海貝索生物技術(shù)有限公司；固體/液體LB培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏試驗的藥敏紙片購自上海伊化有限公司和杭州天和微生物制劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Easy Taq PCR Super Mix均購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物為北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 無菌采取發(fā)病幼蟲在無菌環(huán)境下接種于液體LB培養(yǎng)基，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，接種于LB固體培養(yǎng)基37℃進行培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 生化鑒定試驗 采用生化鑒定儀進行生化鑒定。

1.2.3 細(xì)菌DNA提取 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的基因組DNA。

1.2.4 PCR鑒定 細(xì)菌16SrRNA 序列的擴增采用細(xì)菌通用引物。

引物序列如下:

正向引物27F:5′--AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG--3′

反向引物1 4 9 2 R:5′--T A C G G(C/T)TACCTTGTTACGACTT--3′

PCR反應(yīng)體系（25μl）：上下游引物各1 μl，2×Easy Taq PCR Super Mix 12 μl，無菌水9 μl，DNA模板2 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，45 s，72 ℃延伸90 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗證片段大小與預(yù)期相符合后，送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序并比對測序結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗 藥敏試驗采用藥敏紙片擴散法進行頭孢他啶、慶大霉素和克林霉素等21種常用抗生素的抗菌敏感性測試37 ℃培養(yǎng)20 h后測量各藥物的抑菌圈大小，以判斷各種藥物對該菌的敏感性。

1.2.6 同源性比較 運用DNAStar軟件的MegAlign程序進行多重序列同源性比對。

1.2.7 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 應(yīng)用Mega5.0分析軟件進行分析，通過Neighbor-Joining方法構(gòu)建遺傳系統(tǒng)進化樹。

表1 生化鑒定

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)及培養(yǎng)特性

分離菌株SHZXF1為革蘭氏陽性球菌，散在、多個聚集在一起分布（見圖1）。LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后，形成灰白色的邊緣整齊、圓形凸起、表面濕潤光滑的菌落（見圖2）。

圖1 分離菌鏡檢形態(tài)（革蘭染：10×100）

圖2 分離菌在LB瓊脂平板上菌落形態(tài)

2.2 生化鑒定

生化鑒定結(jié)果見表1。

2.3 PCR鑒定

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離菌株（SHZXF1）DNA PCR擴增產(chǎn)物片段在1 000～1 00 bp之間，與預(yù)期目的片段1 400 bp相符（見圖3）。

圖3 PCR產(chǎn)物凝膠電泳

2.4 同源性比較

將分離菌SHZXF1 16SrRNA 基因序列在NCBI上進行核苷酸同源性比對，結(jié)果顯示分離菌SHZXF1與Gen Bank登錄的中國黑龍江（EF528296.1）、智利圣地亞哥（EU794392.1）、英國北愛爾蘭（FJ794392.1---FJ795683.1）、印度（KM010146.1，KT26062.1）、法國（LC383925.1）等多株緩慢葡萄球菌同源性均達99.2%以上（見圖4）。

2.5 系統(tǒng)進化樹

圖4 16SrRNA基因核苷酸序列與參考序列同源性比對

將分離菌SHZXF1 16SrRNA 基因序列與在NCBI登陸的緩慢葡萄球菌基因序列進行遺傳進化樹構(gòu)建，結(jié)果顯示分離菌SHZXF1與中國黑龍江（EF528296.1）、智利圣地亞哥（EU794392.1）、英國北愛爾蘭（FJ794392.1---FJ795683.1）、法國（LC383925.1）聚為同一支，與印度（KT260602.1、KT260615.1）聚為一大支（見圖5）。

圖5 16SrRNA基因核苷酸序列與參考序列系統(tǒng)進化樹

2.6 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果見表2。

表2 藥敏試驗

3 討論

葡萄球菌屬包含30多種葡萄球菌，但是只有3種葡萄球菌有細(xì)胞色素C而呈氧化酶陽性反應(yīng)，松鼠，緩慢和解酪葡萄球菌[9]。緩慢葡萄球菌與松鼠葡萄球菌的生物學(xué)特性非常相近，曾屬于松鼠葡萄球菌的遲緩亞種，緩慢葡萄球菌與松鼠葡萄球菌區(qū)別在于分解棉子糖陽性。解酪葡萄球菌與松鼠葡萄球菌區(qū)別在于分解木糖、纖維二糖、甘露醇反應(yīng)陰性[8]。因此，依靠細(xì)菌的特殊生化特性，可以對氧化酶陽性葡萄球菌作出鑒定。

緩慢葡萄球菌一度只被認(rèn)為是寄生在山羊和綿羊皮膚及粘膜上的正常菌群[10]，但是，近年來更多的研究表明，該菌跟一些疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，盛相鵬等報道了緩慢葡萄球菌可以造成倉鼠的全身性菌血癥，并可以導(dǎo)致小鼠的慢性死亡；劉福來等研究表明緩慢葡萄球菌可以造成豬肺炎，引起死亡的病原菌[4,5,8,9]。

本研究從生病的熊蜂幼蟲中分離得到緩慢葡萄球菌，通過與16SrRNA基因進行了PCR鑒定及基因同源性比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該分離株與中國黑龍江、智利圣地亞哥、英國北愛爾蘭、印度、法國等多株緩慢葡萄球菌同源性均達99.2%以上，這也說明，緩慢葡萄球菌雖然在世界多國存在，但是彼此之間的基因差異性極小。藥敏試驗研究表明，該分離株對多種抗生素敏感，可能是因為在目前我國熊蜂人工飼養(yǎng)階段還沒有過多使用抗生素來進行疫病防治。這也為以后熊蜂人工飼養(yǎng)期間疫病的防控提供了理論依據(jù)。

緩慢葡萄球菌與多種疾病密切相連，受到越來越多的關(guān)注，但是目前國內(nèi)外對緩慢葡萄球菌的研究較少，特別是在蜂上的研究未見報道，其對蜂的致病性及臨床意義有待進一步的研究，這對蜂病的防控及安全健康養(yǎng)殖具有重要意義。