陳曉潔，李新蘋，何高明＞，王 鋼，凌 晨，張 飛

（1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832000；2.天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830000）

氣腫疽也稱為黑腿病，其病原菌是氣腫疽梭菌，該病被列為第三類傳染病，是一種嚴重的人畜共患細菌傳染疾病，可引起發(fā)熱、嚴重的肌壞死、水腫，最終導致受感染動物死亡，對全球范圍的畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。氣腫疽梭菌是一種嚴格的厭氧、孢子形成、具有組織毒性、單形性和運動性的革蘭氏陽性致病菌，其生存能力強，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[1]。美國和日本報道人感染氣腫疽梭菌死亡的案例，從而打破了氣腫疽梭菌只感染動物的言論，也將該病視為重要研究對象[2]。

黑腿病是影響反芻動物最古老的臨床疾病之一，但其發(fā)病的確切機制仍不清楚，關于氣腫疽梭菌產(chǎn)生的毒素和毒力因子的作用也存在知識缺口[3，4]。CctA是 Joachim Frey等經(jīng)過全基因序列分析得出的一種新型蛋白質毒素，屬于細菌毒素殺白細胞素超家族β-微孔形成毒素[5]。其具有很強的致病性，是氣腫疽梭菌的主要細胞毒素和溶血素[5]。有研究表明，將重組CctA接種動物后，可針對氣腫疽梭菌的感染產(chǎn)生保護作用，因此，在預防黑腿病疫苗的研究中是非常有價值的候選抗原[6]。本研究擴增出氣腫疽梭菌的細胞毒素CctA基因序列，并通過氨基酸序列分析該基因編碼蛋白質的理化性質和功能域，預測該蛋白的二級結構、三級結構，旨在為研究氣腫疽梭菌CctA基因功能提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

氣腫疽梭菌C54-2標準菌株購自中國藥品監(jiān)察所。Ex Taq酶、DL5000 DNA Maker購自TaKaRa寶生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中公布的CctA基因序列（登錄號：JQ692583），采用primer Premier 5.0軟件設計編碼序列的特異性引物。引物序列為：上游引物CctA-F：5'-CGAG CTCATGATAAAAAGAATATTAATGCTTGCTTTA GC-3'；下游引物CctA-R：CCGCTCGAGTTAATA TCCTGCATGCTCAACAGTATGG-3'。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 CctA基因的擴增 以氣腫疽梭菌C54-2標準菌株的基因組為模板，PCR擴增CctA基因片段。反應體系50 ul：Taq酶25 ul，引物CctA-F和CctA-R各1 ul，DNA模板2 ul，ddH2O 21 ul。PCR反應條件為：95℃預變性，5 min；95℃變性，45 s；58℃退火，45 s；72℃延伸，45s；72℃終延伸，10 min，共30個循環(huán)。反應結束，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.3 CctA編碼蛋白的相關生物信息學分析 對CctA編碼蛋白的理化性質預測應用ExPASY在線分析軟件ProtParam完成，具體內(nèi)容包括氨基酸組成、分子量、等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)等。此外，利用ProtScale工具還進一步對該蛋白的親水/疏水性作在線預測，以確定該蛋白在生理條件下是屬于親水性蛋白還是疏水性蛋白。在線軟件TMHMM對CctA編碼蛋白的跨膜結構域進行預測和分析。SignaIP 4.1 Server在線預測CctA編碼蛋白氨基酸序列信號肽。利用在線軟件NetNGlyc 、NetOGlyc 4.0 Server預測CctA編碼蛋白的糖基化位點，NetPhos 3.1 Server預測CctA編碼蛋白的磷酸化位點。通過SOPMA、SWISSMODEL軟件分別對其二級、三級結構進行預測。利用在線軟件 ABCpred對CctA編碼蛋白潛在的B細胞抗原表位進行預測。

2 結果與分析

2.1 氣腫疽梭菌CctA基因擴增結果

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在970 bp處出現(xiàn)特異條帶（見圖1），與預期片段大小相符，說明通過PCR擴增得到CctA基因片段。

圖1 CctA全長基因PCR擴增

圖2 CctA編碼蛋白疏水性分析

2.2 CctA編碼蛋白的結構和功能預測

2.2.1 CctA編碼蛋白的理化性質分析 應用ExPASY在線分析軟件ProtParam對CctA編碼蛋白的理化性質分析后，該蛋白分子量約為35.57KD，其分子式為C1577H2411N421O503S8，由317個氨基酸組成；CctA蛋白中帶正電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為31，帶負電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為29；等電點（PI）理論值為6.13；在哺乳動物體外培養(yǎng)細胞中的半衰期約為30 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h；脂溶指數(shù)為69.50；不穩(wěn)定指數(shù)為28.28（＜40為穩(wěn)定蛋白），屬于穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 CctA蛋白氨基酸序列的親疏水性分析 使用ProtScale分析CctA蛋白的親疏水性氨基酸殘基分布（見圖2），在第9位氨基酸處有最大疏水值為2.222，在第291位氨基酸處有最小疏水值為-2.833，其平均疏水值為-0.496，預測該蛋白為親水性蛋白。

圖3 CctA編碼蛋白信號肽預測

圖4 CctA蛋白N-糖基化位點預測

2.2.3 CctA蛋白的結構預測 利用TMHMM對CctA編碼蛋白的跨膜結構域進行預測和分析，顯示CctA蛋白不具有跨膜結構。表明為該蛋白全部1-317位氨基酸序列均屬于膜外側，不存在跨膜螺旋區(qū)。SignaIP 4.1 Server在線預測CctA編碼蛋白氨基酸序列，分析表明CctA蛋白于第1～29位氨基酸存在信號肽序列（見圖3）。應用interpro在線軟件預測CctA蛋白的保守域和功能結構，分析表明CctA蛋白于34～313位有1個殺白細胞素成孔超家族蛋白，且含有殺白細胞素結構域位于第62～309位。經(jīng)UniProt的Blast比對分析顯示，CctA與肉毒桿菌α溶血素有相似性；與蠟樣芽胞桿菌溶血素Ⅱ相似性為35.9%；與金黃色葡萄球菌α溶血素相似性為30.9%。

2.2.4 蛋白質糖基化位點及磷酸化位點的預測 通過NetNGlyc 1.0 Server和NetOGlyc 4.0 Server軟件對氨基酸序列進行N-糖基化位點及O-糖基化位點預測，得分高于0.50分時才會被預測為糖基化位點，經(jīng)預測顯示該蛋白有4個N-糖基化位點（見圖4），1個O-糖基化位點。通過NetPhos 3.1 Server 軟件對CctA蛋白進行磷酸化位點預測，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白多數(shù)在絲氨酸處最可能通過相應位點的磷酸化來實現(xiàn)其功能的調控，絲氨酸位點的最大值多數(shù)在0.99以上，且多數(shù)屬于絲氨酸＞蘇氨酸＞酪氨酸，其中含有絲氨酸磷酸化位點39個；蘇氨酸磷酸化位點18個，酪氨酸磷酸化位點15個，由此表明，CctA蛋白在絲氨酸和蘇氨酸處的磷酸化位點較多，這一結果也說明了該蛋白在絲氨酸與酪氨酸處更易發(fā)生磷酸化（見圖5）。

圖5 CctA蛋白磷酸化位點預測

圖6 CctA編碼蛋白的二級結構預測

2.2.5 CctA蛋白的二級、三級結構預測 通過SOPMA軟件對CctA編碼蛋白氨基酸序列進行二級結構的預測，顯示該蛋白有31個α-螺旋，占所有氨基酸比例的9.78%；20個β-轉角，占所有氨基酸比例的6.31%；97個延伸鏈，占所有氨基酸比例的30.60%；169個無規(guī)卷曲，占所有氨基酸比例的53.31%（見圖6）。應用SWISS-MODEL預測得到CctA編碼蛋白的三維結構模型（見圖7），該模型與模板序列4i0n.1.A的相似度為50.18%

圖7 CctA編碼蛋白的三級結構預測

2.2.6 CctA編碼蛋白質潛在抗原表位的預測 利用在線軟件 ABCpred對CctA編碼蛋白潛在的B細胞抗原表位進行預測，結果顯示該蛋白有22個優(yōu)勢的B細胞抗原表位，分別是33～47位、105～120位、212～227位等。利用在線軟件NetMHCIIpan 3.1 Server對CctA編碼蛋白的抗原表位進行預測，限制性 Th 細胞表位為DRB1-0101，得到3個強結合多肽段和33個弱結合多肽段。

3 討論

氣腫疽梭菌主要影響牛，其引起暴發(fā)性肌壞死，迅速導致動物死亡。由于黑腿病具有高致死率，因此在全球范圍內(nèi)造成畜牧業(yè)生產(chǎn)的重大損失[1,4,7,8]。據(jù)推測，該菌孢子是由巨噬細胞從腸道或口腔損傷處運送到肌肉的，一旦進入這些組織，孢子就處于休眠狀態(tài)，直到形成厭氧環(huán)境，就會導致孢子的增殖和外毒素的釋放[9]。Jayaramaiah等[10]鑒定了氣腫疽梭菌的一些細胞表面相關蛋白，如烯醇化酶、黃素蛋白等，但這些表面相關蛋白在預防黑腿病中的作用還需進一步研究。有研究表明，DNAse、透明質酸酶和唾液酸酶、鞭毛蛋白以及氣腫疽梭菌毒素A（CctA）均為氣腫疽梭菌的重要毒力因子[11-14]。其中最典型的CctA是氣腫疽梭菌的主要細胞毒性和溶血性[5]，表明除CctA外，無其他可產(chǎn)生溶血活性的物質。CctA在全球50多年間采集的氣腫疽梭菌菌株之間完全保守[1]，它們都編碼相同的CctA的氨基酸序列，進而證明了從易與氣腫疽梭菌混淆的敗血癥梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾維梭菌、肉毒梭菌、艱難梭菌等相關菌株中不能擴增出CctA基因。

CctA蛋白結構域分析顯示，該蛋白無跨膜區(qū)，有信號肽存在，于34～313位有1個殺白細胞素成孔超家族蛋白，且含有殺白細胞素結構域位于第62～309位。這與Frey等[5]報道的CctA屬于殺白細胞素超家族β-桶狀造孔毒素家族相一致。分析顯示，CctA與肉毒桿菌α溶血素有相似性；與蠟樣芽胞桿菌溶血素Ⅱ相似性為35.9%；與金黃色葡萄球菌α溶血素相似性為30.9%，也佐證了CctA與肉毒桿菌α溶血素有相似性[15]；與蠟樣芽胞桿菌溶血素II[16]有48%氨基酸相似；與金黃色葡萄球菌α毒素有50%氨基酸相似的報道。經(jīng)分析表明，該蛋白有4個N-糖基化位點，1個O-糖基化位點，該蛋白有1個糖基化位點，周小菊等[17]表明，糖基化修飾差異，可能會影響相關蛋白的表達水平、結構及功能，對重組蛋白生物學活性及免疫原性均有重要影響。為CctA重組蛋白的研究提供一定參考。預測該蛋白有多個磷酸化位點，而蛋白質的修飾往往也影響這蛋白的穩(wěn)定性，研究表明，一些蛋白底物的絲氨酸或蘇氨酸位點磷酸化后與E3泛素連接酶的結合力增強，其穩(wěn)定性會明顯減弱[18]。CctA蛋白二級結構分析顯示含有大量無規(guī)卷曲，是構成酶活性部位和其他蛋白質特異的功能部位[19]。由此可推測該蛋白可能含有較多抗原表位，這一結論也在抗原表位預測中得到證實。蛋白質的結構及功能預測為找到其致病的分子機理提供一定依據(jù)，對氣腫疽的免疫及防治工作具有重要意義。