岑曼益，藺國(guó)珍，羅斌漢，王逢會(huì)，蔡葵蒸＞

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000）

家養(yǎng)反芻動(dòng)物的消化道線蟲(chóng)是全世界普遍發(fā)生的主要寄生蟲(chóng)病，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來(lái)，隨著驅(qū)蟲(chóng)藥的廣泛使用，目前體內(nèi)寄生蟲(chóng)對(duì)常用三大類(lèi)驅(qū)蟲(chóng)藥（苯并咪唑類(lèi)、阿維菌素/伊維菌素、左旋咪唑）的抗藥性頻繁發(fā)生且在一些國(guó)家和地區(qū)流行并呈蔓延之勢(shì)[1-3]。為了阻止寄生蟲(chóng)抗藥性的繼續(xù)傳播，人們探討利用線蟲(chóng)的天敵進(jìn)行生物防治[4]。食線蟲(chóng)真菌在自然界中作為線蟲(chóng)的天敵而存在，其中D.flagrans在培養(yǎng)期間能夠產(chǎn)生大量雙層壁的厚垣孢子，能夠抵抗動(dòng)物消化道內(nèi)的消化酶而不被滅活[5]。目前在國(guó)外，D.flagrans作為動(dòng)物胃腸線蟲(chóng)生物防治的候選菌種，已取得具有應(yīng)用前景的成果[6]。研制適宜的劑型對(duì)于家畜寄生線蟲(chóng)的生物防治是非常重要的，這就要求不僅要保持D.flagrans孢子具有穩(wěn)定的活性傳遞到動(dòng)物的糞便中發(fā)揮有效地捕殺L3作用，而且需適合于投放至飼料中便于飼用、保存和運(yùn)輸。本研究將D.flagrans厚垣孢子凍干制備成一種生防產(chǎn)品，測(cè)定其對(duì)動(dòng)物寄生線蟲(chóng)的捕殺能力，以便為將來(lái)生產(chǎn)中應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

捕食線蟲(chóng)性真菌D.flagrans分離株（SDH035）是本實(shí)驗(yàn)室自2013年從綿羊糞堆分離純化獲得，GeneBank中18S rRNA、ITS1、5.8 S rRNA、ITS2和28 S rRNA部分序列的登錄號(hào)為KY288614.1，菌種（菌種編號(hào)：CGMCCNO.11210）保存于中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)微生物中心，實(shí)驗(yàn)室日常使用的菌種于2 %玉米粉瓊脂（2 % CMA）斜面中4 ℃保存。

1.2 菌種培養(yǎng)及凍干制劑的制備

將保存于2% CMA斜面的培養(yǎng)物，接種于水瓊脂（WA）平板的中央，30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。經(jīng)純凈檢查合格后，用無(wú)菌手術(shù)刀切取大小約為4 mm×4 mm的小塊，轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平皿的中央，30 ℃培養(yǎng)6 d。然后切取PDA上生長(zhǎng)的菌塊（大小約為4 mm×4 mm）轉(zhuǎn)接于含有120 ml沙堡氏肉湯（pH 6.5），置搖床180 rmp、28 ℃避光振蕩培養(yǎng)7 d。將上述培養(yǎng)物旋渦振蕩后，取100 ml接種于含有谷物聯(lián)合培養(yǎng)基的具有細(xì)菌濾膜的聚乙烯塑料袋中（玉米660 g，小麥330 g，自來(lái)水670 ml，121 ℃高壓滅菌30 min），混勻并火焰密封。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)21 d，用0.05%滅菌吐溫-80洗脫，旋渦振蕩2～3 min，兩層紗布過(guò)濾以除去部分菌絲體，抽樣用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)厚垣孢子的數(shù)量，調(diào)節(jié)厚垣孢子濃度約5×105個(gè)/ml，加入與菌懸液等量的凍干保護(hù)劑（β-環(huán)狀糊精），置于真空冷凍干燥機(jī)中（FD-1C-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司），在冷阱溫度-45～-50 ℃、真空度8～10 Pa的條件下凍干15 h，先后制備數(shù)批樣品，密封于疫苗瓶中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

從甘肅省榆中縣周?chē)群筚?gòu)買(mǎi)3～4月齡、體重17～21 kg（平均體重為18 kg）小尾寒羊12只，按照Cai等[7]的方法，每只試驗(yàn)綿羊采用丙硫咪唑和左旋咪唑按推薦劑量聯(lián)合驅(qū)蟲(chóng)1次以驅(qū)除動(dòng)物體內(nèi)已存在的寄生蠕蟲(chóng)。7 d后將實(shí)驗(yàn)室保存的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（Haemonchus contortus）L3經(jīng)活力檢查合格后，每只試驗(yàn)綿羊用改良的灌喂裝置（即20 ml注射器連接一個(gè)膠管）經(jīng)口灌服10 000條L3，動(dòng)物每天飼喂苜蓿干草及少量混合精料，自由飲水。接種21 d后，進(jìn)行糞便蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)，以確定感染程度，待試驗(yàn)綿羊人工感染成功后備用。

1.4 凍干制劑體外殺蟲(chóng)效果測(cè)定

分別取4 ℃保存1年和2年的三批凍干制劑（20161001、20161101和20161102），每批每次測(cè)定時(shí)用蒸餾水溶解成菌懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)孢子濃度約為5×105個(gè)/ml。用糞袋收集人工感染綿羊糞便，將糞便碾碎后，按照Cai等[7]所描述的方法，稱(chēng)取10 g糞便樣品置于直徑為5.5 cm平皿中，試驗(yàn)組每個(gè)平皿加入2 ml的菌懸液，混合均勻，對(duì)照組稱(chēng)取相同量的糞便，加入2 ml蒸餾水（不含真菌）。將上述平皿置于直徑為9 cm平皿中并在該平皿底部添加10 ml左右的蒸餾水以保持培養(yǎng)濕度，平皿加蓋后，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，期間觀察糞便濕度。待培養(yǎng)終止后，按Cai等[8]所描述的方法進(jìn)行幼蟲(chóng)分離和計(jì)數(shù)，分別計(jì)算各組中所獲L3的平均數(shù)，殺蟲(chóng)率計(jì)算公式如下：

1.5 數(shù)據(jù)處理

體外試驗(yàn)中，采用SPSS（Version 23.0）軟件計(jì)算對(duì)照組和試驗(yàn)組中L3的平均數(shù)，通過(guò)方差分析在5%的概率水平判斷差異的顯著性。

2 結(jié)果

三批凍干制劑在4 ℃保存1年時(shí)，在體外試驗(yàn)期間，本制劑中D.flagrans孢子在綿羊糞便中能夠萌發(fā)，試驗(yàn)組中所獲得的L3平均數(shù)顯著地低于對(duì)照組，其對(duì)綿羊糞便中L3的減少率分別為90.07 %、86.77 %和83.31 %（見(jiàn)表1）。上述凍干制劑在4 ℃保存2年時(shí)，試驗(yàn)組和對(duì)照組所獲得的L3平均數(shù)差異仍顯著，對(duì)綿羊糞便中L3的減少率分別為76.61 %、84.59 %和73.04 %（見(jiàn)表2）。從表1和表2可知，在4 ℃貯存條件下保存1年后隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，D.flagrans對(duì)綿羊糞便中幼蟲(chóng)的捕殺力有下降趨勢(shì)。

表1 4 ℃保存1年后凍干制劑的體外殺蟲(chóng)試驗(yàn)

表2 4 ℃保存2年后凍干制劑的體外殺蟲(chóng)試驗(yàn)

3 討論

家畜寄生線蟲(chóng)生防制劑是一種用食線蟲(chóng)真菌制備的、適用于飼喂動(dòng)物的且含有活菌的新型獸藥，目前處于探討階段，主要是經(jīng)動(dòng)物飼用后在糞便中發(fā)揮捕殺幼蟲(chóng)從而減少感染性幼蟲(chóng)的作用。為了使該類(lèi)產(chǎn)品能夠在生產(chǎn)中得到推廣應(yīng)用，因此研究生防制劑劑型、貯藏方法及保存期是十分必要的。

真空冷凍干燥法對(duì)保持微生物分離株特性的穩(wěn)定性有諸多優(yōu)點(diǎn)，可使微生物存活較長(zhǎng)時(shí)間[8,9]。但食線蟲(chóng)真菌凍干后作為生防制劑使用，不僅要保持真菌的存活性能，更重要的是要保持其捕食線蟲(chóng)的能力。目前，關(guān)于D.flagrans凍干制劑保存期效果尚無(wú)研究。筆者對(duì)含有D.flagrans海藻酸鈉顆粒制劑在4 ℃、-20 ℃、室溫和戶外貯存1年的保存期進(jìn)行了測(cè)定[10]，該制劑在室溫、戶外條件下貯存至少可保持6個(gè)月的殺蟲(chóng)活性。Braga等[11]評(píng)估了保存在硅膠粒中的D.flagrans菌種對(duì)馬小圓型線蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)（L3）捕殺效果，試驗(yàn)證明在硅膠粒中4 ℃貯存7年仍可存活并對(duì)馬小圓型線蟲(chóng)L3的具有捕食能力。強(qiáng)力節(jié)叢孢菌（A.robusta）的分生孢子冷凍干燥后4 ℃貯存1個(gè)月對(duì)犬鉤口線蟲(chóng)（Ancylotoma spp.）L3體外殺蟲(chóng)率為75.38 %[12]。

綜上所述，D.flagrans凍干制劑在4 ℃貯存條件下至少可保持1年有效的殺蟲(chóng)活性，這對(duì)于含有活菌的生防制劑產(chǎn)品來(lái)說(shuō)已經(jīng)達(dá)到了應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中的條件，但制備凍干制劑成本高，限制了今后在寄生蟲(chóng)生物防治中大規(guī)模應(yīng)用。目前，在一些熱帶和亞熱帶家畜寄生蟲(chóng)病常年發(fā)生的國(guó)家和地區(qū)，利用當(dāng)?shù)胤蛛x的D.flagrans分離株研制成的顆粒制劑已進(jìn)行了田間試驗(yàn)[13]，但大規(guī)模生產(chǎn)D.flagrans厚垣孢子的問(wèn)題在全世界尚未突破。我國(guó)當(dāng)?shù)胤蛛x菌株所研制的制劑目前尚未有田間試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，田間試驗(yàn)需收集較長(zhǎng)時(shí)期EPG和環(huán)境中感染性幼蟲(chóng)減少的觀察資料。因此，凍干制劑的田間試驗(yàn)需要進(jìn)一步研究。