陳冉冉，朱 倩，趙 敏，黃志偉

東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620

在工業(yè)化進程中，重金屬得到廣泛使用并越來越多地釋放到環(huán)境中。重金屬難以用生物化學(xué)方法降解，能夠通過食物鏈積累從而威脅人類健康[1]，因此全世界越來越關(guān)注重金屬污染問題。國際上Cr是與Hg、Cd、Pb并列的四種主要污染物之一[2]。環(huán)境中鉻的主要存在形式為：Cr6+和 Cr3+。Cr6+是鉻發(fā)揮毒性的主要形式，并在1987年被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)確認為人類致癌物[3]。在鉻酸鹽制造、鍍鉻、鉻鐵生產(chǎn)和不銹鋼焊接過程中，Cr6+出現(xiàn)的頻率較高[4]。通常認為Cr3+低毒，在調(diào)節(jié)血糖水平中起著重要的作用[5]，三價鉻鹽，包括氯化鉻、煙酸結(jié)合鉻、聚煙酸鉻和吡啶甲酸鉻，被用作微量營養(yǎng)素和膳食補充劑[6]。但Cr3+作為必需微量元素仍存在爭議[7]，KSHEMINSKA[8]和我們實驗室[9]的研究結(jié)果都證實了Cr3+和Cr6+對活細胞都是有害的，在一定濃度下釀酒酵母對兩者的積累效率是基本相同的。

重金屬引起氧化應(yīng)激是非常普遍的[10]，鉻也不例外，Cr能夠引起氧化損傷發(fā)揮其毒性[11]，谷胱甘肽(GSH)是一種抗氧化劑，在保護細胞免受氧化劑和重金屬引起的應(yīng)激中起著重要的作用，是抵御自由基攻擊的第一道防線[12]，GSH1是γ谷氨酰半胱氨酸合成酶基因，催化GSH生物合成的第一步，對于抵抗氧化應(yīng)激和重金屬解毒過程中不可或缺[13]。

微生物吸附處理重金屬廢水是一種經(jīng)濟有效的生物技術(shù)。釀酒酵母廣泛用于食品和飲料生產(chǎn)中，容易使用廉價培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，同時也是發(fā)酵工業(yè)的大量副產(chǎn)品，易于獲得，且易于在分子水平上操作[14]。因此，本文以釀酒酵母為模型，檢測了三價鉻和六價鉻對酵母生長的影響，并研究了不同價態(tài)的鉻對酵母胞內(nèi)谷胱甘肽含量影響。通過過表達GSH1來進一步驗證兩種價態(tài)的毒理機制不同，有望找到不同價態(tài)鉻毒性的相關(guān)機理，為工業(yè)含鉻廢棄物防治和微生物治理環(huán)境鉻污染提供合理的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

菌株：在該研究中使用的菌株主要是釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY4741(MATa;his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)、gsh1Δ(BY4741gsh1ΔKanMX)；所用質(zhì)粒為YEplac195-ADH1pr；大腸桿菌E.coliDH5α用于質(zhì)粒擴增，以上均由本實驗室提供。

培養(yǎng)基：菌株在YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖)或含有2%葡萄糖的完全合成(SC)培養(yǎng)基或酵母選擇性營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基(SC-Ura培養(yǎng)基)，完全合成SC培養(yǎng)基中不加尿嘧啶，于30 ℃培養(yǎng)。根據(jù)實驗需要，加入不同價態(tài)的鉻鹽至培養(yǎng)基中。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞死亡率測定

將野生型菌株接種于4 mLYPD培養(yǎng)基中過夜；將活化的細胞轉(zhuǎn)移到4 mL不同濃度的CrCl3(150 μmol/L)、K2Cr2O7(150 μmol/L、300 μmol/L)和或不加CrO3(300 μmol/L)鉻鹽的SC培養(yǎng)基中，處理細胞24 h。取適量處理和對照菌液梯度稀釋滴至YPD平板培養(yǎng)2 d～3 d，計數(shù)各組的單克隆數(shù)量，算出細胞死亡率。(對照為0，重復(fù)三次)。

1.2.2生長曲線[15]

將活化的細胞轉(zhuǎn)到新鮮的SC液體培養(yǎng)基中，使其起始OD值為0.1，30 ℃,180 r/min震蕩培養(yǎng), 在一定的間隔時間內(nèi)用分光光度計測定OD600的值, 繪制生長曲線分析酵母細胞的生長狀況。

1.2.3谷胱甘肽(GSH)含量測定

依據(jù)實驗室已建立的GSH含量測定方法[16]，從對照及CrCl3(150 μmol/L)、CrO3(300 μmol/L)、K2Cr2O7(300 μmol/L)處理過的酵母細胞中提取GSH，測定樣品的GSH含量。

1.2.4GSH1基因過表達質(zhì)粒構(gòu)建

在GSH1上下游500 bp左右設(shè)計的包含兩個酶切位點引物：PstI和KpnI，構(gòu)YEplac195—ADH1pr-GSH1的質(zhì)粒。GSH1：F’aactgcAGAAGAATAAAATGGGA CTCTTAG；R’ggggtaCCAATATTCTACGTGCTTGTTA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌并測序確認后，分別轉(zhuǎn)化到酵母BY4741和gsh1Δ菌株中，構(gòu)建GSH1基因過表達菌株，在SC-Ura培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進行斑點實驗分析GSH1過表達對不同價態(tài)鉻脅迫的影響。

1.2.5斑點實驗

將活化的酵母細胞懸浮于10倍稀釋的水中，取5 μL～10 μL菌液滴在對照或添加所需化合物的SC-Ura平板上(150 μmol/L CrCl3、300 μmol/L CrO3和300 μmol/L K2Cr2O7)在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d～5 d，觀察拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種價態(tài)鉻(Cr3+，Cr6+)對真核酵母細胞毒性不同

致死率數(shù)據(jù)顯示出兩種價態(tài)的鉻對細胞的生長都有影響，見圖1，150 μmol/L CrCl3和150 μmol/L K2Cr2O7處理后，三價鉻引起細胞的致死率是低于六價鉻的，300 μmol/L CrO3對細胞的致死率高達65%，300 μmol/L K2Cr2O7對細胞的致死率為55%，兩種價態(tài)的鉻引起的致死率有顯著差異，說明兩種價態(tài)的鉻對細胞的毒性作用不同。而且同為六價鉻，化合物形式不同，致死率也不同，鉻的展現(xiàn)形式?jīng)Q定了其對細胞的毒性作用。

2.2 酵母胞內(nèi)GSH含量和細胞生長之間的關(guān)系

以初始OD600為0.1轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)的BY4741，在不同時間點取樣測OD600，并檢測胞內(nèi)GSH含量。圖2顯示了菌體濃度隨時間延長而增大，GSH含量先增大后減小。從對數(shù)前期(3 h左右)細胞內(nèi)谷胱甘肽升高的最明顯，到菌體細胞生長進入對數(shù)期(6 h左右)胞內(nèi)谷胱甘肽處于較穩(wěn)定的高水平階段，隨后有下降趨勢。因此在后續(xù)的實驗中選取3 h、6 h兩個時間點取樣檢測GSH含量。

2.3 三氯化鉻(Ⅲ)對酵母胞內(nèi)GSH含量影響

從圖3看出，隨著三氯化鉻濃度的升高，BY4741胞內(nèi)GSH含量基本不變。在50 μmol/L、150 μmol/L CrCl3濃度下，3 h和6 h細胞內(nèi)的GSH含量基本一致。即使在300 μmol/L CrCl3的處理下，GSH含量與對照基本保持一致。說明Cr3+對胞內(nèi)GSH含量影響不大。

2.4 三氧化鉻(Ⅵ)對酵母胞內(nèi)GSH含量影響

圖4顯示了隨著三氧化鉻濃度的升高，不管是3 h還是6 h處理BY4741，胞內(nèi)GSH含量都呈現(xiàn)降低的趨勢，300 μmol/L CrO3處理的3 h細胞中GSH含量與對照相比減少了約1/3。

圖1 兩種價態(tài)鉻(Cr3+，Cr6+)對酵母細胞致死的影響

圖2 24 h內(nèi)BY4741細胞的生長狀況和胞內(nèi)GSH含量變化

圖3 不同濃度的三氯化鉻處理酵母3 h、6 h后胞內(nèi)GSH變化

圖4 不同濃度的三氧化鉻處理處理酵母3 h、6 h后胞內(nèi)GSH變化

2.5 重鉻酸鉀(Ⅵ)對酵母胞內(nèi)GSH含量影響

隨著重鉻酸鉀處理濃度的升高胞內(nèi)GSH含量都呈現(xiàn)降低的趨勢，見圖5。半抑制濃度重鉻酸鉀(300 μmol/L K2Cr2O7)處理的細胞3 h或6 h，GSH含量僅約為對照的1/2，而且隨著濃度的升高，下降趨勢明顯。這可能是由于重鉻酸鉀進入胞內(nèi)后，Cr6+與GSH結(jié)合消耗了GSH，使得GSH總含量減少。而且Cr6+需要消耗胞內(nèi)GSH還原為低價態(tài)，Cr3+則對細胞內(nèi)GSH水平影響不大。

圖5 不同濃度的重鉻酸鉀處理酵母3 h、6 h后胞內(nèi)GSH變化

2.6 酵母過表達GSH1有利于提高細胞對Cr6+的抗性

在BY4741和gsh1Δ中過表達GSH1，如圖6a，藥物敏感性分析發(fā)現(xiàn)，過表達GSH1并沒有增強150 μmol/L CrCl3處理下細胞的生長狀況，而在300 μmol/L CrO3和K2Cr2O7的平板上，過表達GSH1明顯增強了細胞對Cr6+的抗性。圖6b檢測了超表達菌株中GSH的含量，證明了GSH1基因成功導(dǎo)入并且的確過表達。圖6c的生長曲線得到了與圖6a相同的結(jié)果，過表達GSH1對三價鉻沒有回補效果，但能明顯增加細胞對六價鉻的抗性。圖3、圖4和圖5從側(cè)面也證實了這一點。這說明Cr3+和Cr6+的毒理機制不同，細胞對它們的解毒機制也不同。

a.過表達GSH1菌株對不同價態(tài)鉻的敏感性測試

b.過表達菌株中GSH含量的測定

3 結(jié)論

本文探究了Cr3+和Cr6+都對酵母的生長造成損傷，鉻化合物影響酵母生長的程度取決于鉻的價態(tài)形式。Cr6+處理酵母細胞后胞內(nèi)GSH含量有所下降，而Cr3+處理對細胞內(nèi)GSH含量沒有顯著影響。超表達GSH1能夠加強野生型(BY4741)和部分的恢復(fù)突變型(gsh1Δ)酵母細胞對Cr6+的耐受性，對Cr3+作用不明顯，說明GSH在抵抗Cr6+中發(fā)揮重要作用。這對鉻污染環(huán)境防治提供依據(jù)，為鉻耐受植株和菌株的改造和選育奠定了基礎(chǔ)，同時也為其他重金屬污染的防治提供了參考。