冉雯儀，項 琦，潘云云，姚長洪，張永奎

四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都 610065

微藻是一類廣泛存在于海洋和陸地上的、低等的、可利用光合作用的藻類微生物總稱[1]。微藻通過光合作用固定CO2生產(chǎn)各種細胞內(nèi)代謝物如淀粉(碳水化合物)，脂質(zhì)和蛋白，并且由于光合效率高，固定CO2能力強，生長速度快，培養(yǎng)模式靈活可控和不占用耕地等特點被認為是生物煉制的可持續(xù)原料來源[2]。

微藻可以在光合自養(yǎng)條件下通過營養(yǎng)限制、高光強等方式積累大量淀粉，在制取生物乙醇、生物丁醇等生物質(zhì)能源方面有潛在的應(yīng)用前景[3]。但目前制約其產(chǎn)業(yè)化的主要因素在于生物質(zhì)和淀粉產(chǎn)率過低，使微藻培養(yǎng)、采收和后續(xù)加工的成本過高。提高生物質(zhì)產(chǎn)量(培養(yǎng)液中微藻濃度，g·L-1)和產(chǎn)率(單位時間生產(chǎn)的生物質(zhì)量，g·L-1·d-1)有利于降低微藻培養(yǎng)和采收成本，而目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量和含量(占干重的百分比)的提高則有利于微藻的后續(xù)加工和煉制[4]。因此，微藻淀粉積累的調(diào)控需要同時考慮淀粉含量、生物質(zhì)和淀粉的產(chǎn)量和產(chǎn)率。

應(yīng)用各種化學(xué)物質(zhì)調(diào)控細胞代謝已被證明是一種提高微藻儲能物質(zhì)(主要是脂質(zhì))積累的有效方法[5]。近年來，植物激素、抗氧化劑和相關(guān)通路的激活劑/抑制劑對微藻脂質(zhì)積累的促進作用得到了廣泛的研究[3]。然而，關(guān)于改進微藻淀粉生產(chǎn)的化學(xué)調(diào)節(jié)劑的研究進展很少。γ-氨基丁酸(GABA)是一種存在于植物、動物、細菌和微藻中的四碳非蛋白氨基酸[6]。GABA被認為是一種信號分子，以調(diào)節(jié)植物應(yīng)對生物和非生物脅迫的生長代謝，比如鹽度異常、干旱、內(nèi)澇、冷熱和缺氧[7-10]。最近有文獻報道，在鎘脅迫下，外源添加2.5 mmol/L的GABA可以增加產(chǎn)油微藻Monoraphidiumsp. QLY-1的生物質(zhì)和脂質(zhì)生產(chǎn)，進一步證明了GABA對微藻代謝調(diào)節(jié)的有效性[11]。然而，利用GABA調(diào)控微藻淀粉積累并未見報道。

亞心形四爿藻是一種海洋綠藻，在缺氮條件下該藻具有潛在的淀粉生產(chǎn)能力[12]。為了在提高淀粉產(chǎn)量的同時進一步提高淀粉含量，本研究分析了缺氮培養(yǎng)條件下，GABA對亞心形四爿藻細胞生長、生物質(zhì)積累、淀粉生產(chǎn)和光合作用的調(diào)節(jié)作用，以證明利用外源添加GABA調(diào)控微藻淀粉生產(chǎn)的可行性。

1 材料和方法

1.1 藻株和實驗條件

海洋綠藻亞心形四爿藻(Tetraselmissubcordiformis), 分離于大連附近海域, 經(jīng)過本實驗室純化, 并保存在中國科學(xué)院淡水藻種庫(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology, FACHB-collection), 編號為FACHB-1751。

微藻藻種在人工海水(ASW)中培養(yǎng)[13]，添加0.81 g·L-1的Tris和0.33 mL·L-1冰乙酸。在生長指數(shù)后期收集藻細胞，用缺N的人工海水(ASW-N)洗滌兩次后重懸于ASW-N中，調(diào)整細胞初始接種密度(ICD)OD750為3.5。在缺N培養(yǎng)模式下添加GABA最終濃度為10 mmol/L，并以未添加GABA(0 mmol/L)的藻在相同條件下培養(yǎng)做對照。

藻細胞在YAO等人[14]描述的工作體積為500 mL (直徑為50 mm, 高度為400 mm) 的600 mL的玻璃泡柱光生物反應(yīng)器中進行自養(yǎng)培養(yǎng)。通入空氣流量0.4 vvm, CO2含量2%, 培養(yǎng)溫度(25±2) ℃。連續(xù)單排照光, 光照強度150 μmol·m-2·s-1。所有實驗設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 細胞生長的測定

在分光光度計(AOE, UV/Vis A-360, 上海, 中國) 750 nm 處測定細胞生長的光密度[12]。細胞干重(DW, g·L-1)根據(jù)YAO[14]的方法測定。

1.3 光合活性分析

應(yīng)用快速熒光誘導(dǎo)動力學(xué)(OJIP-test)對微藻的光合性能進行評價。光合系統(tǒng)Ⅱ(PhotosystemⅡ, PSⅡ)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm, 在J-step(Vj)和I step(Vi)的相對可變熒光和單位 PSⅡ 捕光截面的能量耗散DIo/CS0用葉綠素?zé)晒鈨xOs30p+(Opti-sciences, USA)測定葉綠素a熒光進行評估。各項參數(shù)Fv/Fm, DIo/CS0,Vj和Vi根據(jù)STRASSERF和SRIVASTAVA[15]進行如下計算:

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

DIo/CS0=F0(1-Fv/Fm)

Vj=(Fj-F0)/(Fm-F0)

Vi=(Fi-F0)/(Fm-F0)

Fv表示飽和脈沖誘導(dǎo)的最大熒光Fm與初始熒光F0之間的葉綠素?zé)晒庾兓?，F(xiàn)j和Fi分別為J和I時期的熒光。

1.4 生化成分分析

Ps=(DWtCst-DW0Cs0)/t

式中:DWt和DW0分別是t時刻和初始時刻的干重，Cst和Cs0分別是t時刻和初始時刻的淀粉含量。蛋白質(zhì)的提取參照YAO[13]的方法，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白含量(碧云天，中國)。

1.5 鏡檢觀察細胞淀粉積累

以1/1 (v/v)的海藻懸浮液/碘溶液 (0.2% I2, 2% KI) 比例染色，并在光學(xué)顯微鏡(BMC303-IPL, 上海, 中國)下觀察藻細胞中的淀粉積累。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果以三個獨立實驗的平均值±SD表示。采用SPSS 16.0 軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進行統(tǒng)計分析。兩組比較采用雙尾分布student配對t檢驗。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 GABA對細胞生長的影響

為了評價添加GABA是否能提高脅迫條件下微藻淀粉的積累，研究在N缺乏的條件下添加10 mmol/L GABA于亞心形四爿藻，并與未添加GABA(0 mmol/L)的藻作對比。雖然藻細胞在缺氮下受到脅迫，但細胞可以利用內(nèi)源性氮增殖，細胞密度在4 d內(nèi)達到最大，之后停止生長。從培養(yǎng)的第0 d到第4 d，無添加(0 mmol/L) GABA的細胞密度增長了66%，而添加10 mmol/L GABA的藻細胞密度增長了54%(圖1a)，表明GABA添加對細胞分裂有一定的抑制作用。在培養(yǎng)5 d時，添加10 mmol/L GABA的細胞密度為未添加GABA(0 mmol/L)的89.7%。然而，添加GABA對細胞生物質(zhì)積累沒有顯著影響，缺氮培養(yǎng)4 d，與未添加組同樣細胞干重大約增加了40.6%，均達到4.5 g·L-1(圖1b)。這些結(jié)果與高等植物的情況不一致，比如添加外源GABA于玉米可以在幼苗長度和生物質(zhì)積累方面改善幼苗生長[17]，說明GABA可能在亞心形四爿藻中發(fā)揮不同的作用。

星號(*)代表與0 mmol/L GABA對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)
圖1 缺N條件下GABA對亞心形四爿藻

2.2 GABA對淀粉積累的影響

與細胞生長和生物質(zhì)積累的情況不同，GABA可以促進亞心形四爿藻淀粉的積累。在培養(yǎng)的第1 d，未添加GABA的藻細胞淀粉呈現(xiàn)下降趨勢(圖2a)，這是由于細胞利用內(nèi)源性N進行細胞分裂，藻細胞降解淀粉為細胞分裂和細胞骨架(比如蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì))的生物合成提供能量和碳骨架[18]；而添加10 mmol/L GABA的藻在培養(yǎng)的第1 d淀粉含量幾乎保持不變，且細胞分裂也受到抑制(圖1a)。藻細胞從第2 d起開始積累淀粉，且添加10 mmol/L GABA的藻細胞淀粉含量比未添加GABA的對照組的淀粉含量高。在培養(yǎng)的第4 d，添加10 mmol/L GABA的藻細胞淀粉含量達到39%DW，而未添加GABA的藻細胞淀粉含量僅為28%DW，表明添加GABA后淀粉含量顯著性提高了39%(P<0.05)(圖2a)。

通過碘染色的藻細胞也反映出添加GABA后淀粉含量的增加。如圖3所示，在缺氮培養(yǎng)的第4 d，添加GABA的藻液與碘染色后在顯微鏡下觀察顏色呈現(xiàn)褐色且比未添加GABA的藻細胞顏色更深，表明GABA促進了微藻細胞的淀粉積累，結(jié)論與圖2中的淀粉生產(chǎn)情況相一致。

此外，從圖4可以看出，在培養(yǎng)的第2 d，添加10 mmol/L GABA的微藻中蛋白含量為20% DW，比未添加GABA的對照組蛋白含量降低了13%。這些結(jié)果表明，GABA可能通過抑制細胞分裂降低淀粉的降解，且改變了光合碳流的分配，即從蛋白質(zhì)合成更多地轉(zhuǎn)換到淀粉的合成，促使藻細胞的淀粉含量提高。

淀粉合成的提高可以減小蛋白和油脂合成過程的CO2釋放[19,20]，提高光合碳固定效率。因此，盡管GABA的添加抑制細胞生長(圖1a)，但淀粉合成提高所帶來的碳儲存效率的增加導(dǎo)致生物質(zhì)積累并不受影響(圖1b)。由于GABA有利于淀粉含量的升高，因此GABA的添加也有利于淀粉產(chǎn)率的提高。如圖2b所示，在培養(yǎng)第4 d，添加10 mmol/L GABA的微藻淀粉產(chǎn)量達到最大值1.72 g·L-1，比未添加GABA的對照組顯著提高了39%(P<0.05)。同樣地，添加10 mmol/L GABA的微藻淀粉產(chǎn)率在第4 d達到最大值0.36 g·L-1·d-1，而0 mmol/L GABA的對照組淀粉產(chǎn)率為0.24 g·L-1·d-1，提高了50%(P<0.05)(圖2c)。

2.3 GABA對光合活性的影響

星號(*)代表與0 mmol/L GABA對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)圖2 缺N條件GABA對亞心形四爿藻

0 mmol·L-1

10 mmol·L-1

圖4 缺氮條件下GABA對亞心形四爿藻蛋白含量的影響

3 結(jié)論

GABA在缺氮培養(yǎng)模式下可以促進亞心形四爿藻淀粉積累。GABA可以調(diào)控亞心形四爿藻細胞分裂和代謝，產(chǎn)生適度的額外脅迫，抑制細胞生長，阻礙淀粉降解，促使細胞將碳流更多地分配到淀粉積累，從而導(dǎo)致藻細胞的淀粉含量、淀粉產(chǎn)量和淀粉產(chǎn)率提高。在N缺乏條件下添加10 mmol/L GABA，可以使亞心形四爿藻淀粉含量、淀粉產(chǎn)量和淀粉產(chǎn)率分別提高39%、39%和50%。添加GABA是提高微藻淀粉生產(chǎn)的有效途徑，可能為淀粉基生物燃料和生物基化學(xué)品的生產(chǎn)提供可持續(xù)的綠色原料。