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        CHO細胞表達抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體工藝優(yōu)化

        2020-04-27 13:19:58史勁松
        工業(yè)微生物 2020年2期
        關(guān)鍵詞:添加物補料外源

        馮 煒,史勁松

        江南大學(xué) 藥學(xué)院,無錫 214122

        血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是重要的促血管生長因素,可提高血管的通透性[1],是誘導(dǎo)腫瘤血管形成的作用最強、特異性最高的血管生長因子[2]。因此,抑制血管內(nèi)皮生長因子可以抑制腫瘤的生長[3]。抗VEGF治療的第一代藥物是諾華公司的Lucentis和羅氏公司的Avastin,前者價格昂貴,而后者價格低廉,在很多國家作為非標簽用藥,市場巨大[3, 4]。抗VEGF治療的第二代藥物是德國拜耳的Eylea和我國成都康弘生物科技有限公司的朗沐,此類藥物是一種融合蛋白,可以與VEGF競爭性結(jié)合VEGF受體,抑制VEGF產(chǎn)生作用,作用比第一代的抗VEGF藥物更強。Eylea目前在海外市場已經(jīng)占據(jù)相當(dāng)大的市場份額,而朗沐在我國已開始臨床三期試驗,表現(xiàn)出顯著的治療效果[5-8]。然而,前兩代抗VEGF治療的藥物都只適用于眼底病治療的藥物,應(yīng)用范圍受到很大的限制。近年來,單克隆抗體類藥物發(fā)展迅猛,已被廣泛用于惡性腫瘤、免疫學(xué)疾病和罕見病等多個適應(yīng)癥的治療[9],目前已有超過300種單克隆抗體藥物處于臨床試驗階段[10]。與第一代和第二代抗VEGF藥物相比,抗VEGF單克隆抗體的應(yīng)用范圍更加廣泛。本研究利用已經(jīng)構(gòu)建好的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)細胞株表達抗VEGF人源化單克隆抗體(VEGF-MA),并對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,以期獲得更高的目的蛋白產(chǎn)量。

        1 材料與方法

        1.1 細胞株

        本研究所用細胞株為重組CHO細胞。目的產(chǎn)物為VEGF-MA,93%的序列為人源,7%的序列為鼠源(位于可變區(qū)的互補決定區(qū)CDR),每個輕鏈由214個氨基酸組成,每個重鏈由453個氨基酸組成,相對分子量為149 000。

        1.2 培養(yǎng)基

        (1) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基:本研究選取14種基礎(chǔ)培養(yǎng)基,編號以及濃度如表1所示。

        表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

        (2) 補料培養(yǎng)基:本研究選取10種補料培養(yǎng)基,編號以及濃度如表2所示。

        表2 補料培養(yǎng)基

        (3) 外源添加物:本研究選取7種能夠促進VEGF-MA表達的外源添加物,為方便添加,將其配制成溶液,溶液濃度以及編號如表3所示。

        表3 外源添加物

        1.3 細胞培養(yǎng)

        1.3.1細胞復(fù)蘇及搖瓶擴增

        從液氮罐中取出凍存細胞37 ℃水浴解凍,將解凍后的凍存液轉(zhuǎn)入裝有8.5 mL CD CHO培養(yǎng)基的離心管中,充分混勻,1 000 r/min離心5 min,棄去上清。將細胞沉淀重新懸浮于5 mL CD CHO培養(yǎng)基中,以0.30×106個/mL~0.90×106個/mL的密度接種于裝有25 mL CD CHO培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。將三角瓶置于CO2搖床中培養(yǎng),CO2濃度、溫度和轉(zhuǎn)速分別為6%、36.5 ℃和130 r/min。每三天對搖瓶中的細胞計數(shù)一次,按(0.4×106~0.6×106)個/mL的密度接種至新鮮培養(yǎng)基,逐級傳代擴增至0.25 L~2 L搖瓶中。

        1.3.2搖瓶培養(yǎng)

        用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將細胞按一定的接種細胞密度接入250 mL擋板搖瓶中,接種體積80 mL,搖床培養(yǎng)參數(shù)為:6% CO2,36.5 ℃,130 r/min。其他工藝參數(shù)按照實驗設(shè)計進行設(shè)定。按相關(guān)實驗方案進行補料,補料體積為初始培養(yǎng)重量的4%,外源添加物體積為初始培養(yǎng)重量的1%。葡萄糖濃度低于2.0 g/L時,添加200 g/L的葡萄糖溶液將葡萄糖濃度提高至4.0 g/L。根據(jù)通氣產(chǎn)生的泡沫情況,適量添加消泡劑。

        1.3.33 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

        用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將搖瓶種子細胞按一定比例稀釋至接種細胞密度設(shè)定值,接入3 L發(fā)酵罐,發(fā)酵罐初始培養(yǎng)體積1.0 L。設(shè)置發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為280 r/min,DO設(shè)定值為40%,與O2通氣量進行關(guān)聯(lián)控制,氧氣通氣流量范圍為(0~500) mL/min,根據(jù)活細胞密度調(diào)整空氣流量設(shè)定值,空氣流量控制范圍為(10~100) mL/min。其他工藝參數(shù)按照實驗設(shè)計進行設(shè)定。pH通過添加通碳酸氫鈉溶液和CO2進行關(guān)聯(lián)調(diào)節(jié)。每天取樣檢測活細胞密度、細胞活率,第3 d、5 d、7 d、9 d、11 d補料,補料體積為初始培養(yǎng)重量的4%,外源添加物體積為初始培養(yǎng)重量的1%。葡萄糖濃度低于2.0 g/L時,添加200 g/L的葡萄糖溶液將葡萄糖濃度提高至4.0 g/L。根據(jù)通氣產(chǎn)生的泡沫情況,適量添加消泡劑。

        1.4 檢測方法

        1.4.1VEGF-MA濃度檢測

        VEGF-MA濃度檢測方法見參考文獻[11]。

        1.4.2VEGF-MA純化

        VEGF-MA純化方法見參考文獻[12,13]。

        1.4.3糖基化水平檢測

        糖基化水平檢測方法見參考文獻[14-16]。

        1.4.4蛋白純度檢測

        蛋白純度檢測方法見參考文獻[14-16]。

        1.4.5電荷異質(zhì)性檢測

        電荷異質(zhì)性檢測方法見參考文獻[14-16]。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

        2.1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)化

        首先選取14種細胞培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,種類如表1所示。分別在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO細胞,考察抗VEGF抗體的生產(chǎn)性能,目的在于選擇最優(yōu)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。目的蛋白產(chǎn)量是體現(xiàn)生產(chǎn)性能的主要指標,在上述14種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO細胞7 d后,發(fā)酵液中的VEGF-MA濃度如圖1所示。從中可以看出,最優(yōu)的批次所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為5#,VEGF-MA的產(chǎn)量為0.70 g/L。此外,使用7#、9#和11#三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基時,也可以獲得較高的目的蛋白產(chǎn)量(0.60 g/L以上)。除目的蛋白產(chǎn)量外,目的產(chǎn)物質(zhì)量也是體現(xiàn)生產(chǎn)性能的重要指標。目的產(chǎn)物質(zhì)量可以依靠其電荷異質(zhì)性、糖基化組分和蛋白純度三個指標判斷。通常情況下,電荷異質(zhì)性≤35.0%、糖基化組分處于50.0%~60.0%之間以及蛋白純度≥85.0%的目的產(chǎn)物被認為質(zhì)量合格。在上述14個批次結(jié)束時刻的發(fā)酵液中分離純化抗VEGF抗體,測定其電荷異質(zhì)性、糖基化組分和蛋白純度,結(jié)果如表4所示??梢钥闯?,5#基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA質(zhì)量較高。綜合目的產(chǎn)物產(chǎn)量及質(zhì)量,選用5#培養(yǎng)基,即ActiCHO P Powder CD,作為后續(xù)研究中所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

        2.1.2補料培養(yǎng)基優(yōu)化

        選取如表2所示的10種補料培養(yǎng)基,在使用ActiCHO P Powder CD基礎(chǔ)培養(yǎng)基的條件下,按照1.3.2小節(jié)所述的方法進行補料操作,以篩選最優(yōu)的補料培養(yǎng)基。培養(yǎng)14 d后,細胞培養(yǎng)液中的VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量分別如圖2和表5所示。綜合考慮VEGF-MA的產(chǎn)量和質(zhì)量,選取8#補料培養(yǎng)基,即CD Efficient Feed C AG,作為后續(xù)研究中使用的補料培養(yǎng)基。補加CD Efficient Feed C AG后,對目的產(chǎn)物質(zhì)量影響不明顯,且VEGF-MA的產(chǎn)量達到2.55 g/L。

        圖1 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        圖2 添加不同補料培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        表4 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基下的VEGF-MA質(zhì)量

        表5 添加不同補料培養(yǎng)條件基下的VEGF-MA質(zhì)量

        2.1.3外源添加物優(yōu)化

        選取如表3所示的7種外源添加物,考察在補加不同外源添加物條件下VEGF-MA的生產(chǎn)性能。在使用ActiCHO P Powder CD基礎(chǔ)培養(yǎng)基和CD Efficient Feed C AG補料培養(yǎng)基的條件下,培養(yǎng)14 d后,細胞培養(yǎng)液中的VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量分別如圖3和表6所示。從中可以看出,添加各種外源添加物條件下,VEGF-MA產(chǎn)量均有不同程度的提高。綜合考慮VEGF-MA的產(chǎn)量和質(zhì)量,選取1#外源添加物,即Sheff-CHO Plus PF ACF。添加該物質(zhì)后,對目的產(chǎn)物質(zhì)量影響不明顯,且VEGF-MA產(chǎn)量由2.54 g/L提高至3.20 g/L。

        表6 補加不同外源添加物條件下的VEGF-MA質(zhì)量

        圖3 補加不同外源添加物條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        2.2 3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化

        2.2.1接種密度優(yōu)化

        將上述研究中所獲得的培養(yǎng)基組合用于3 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)CHO細胞生產(chǎn)VEGF-MA的過程,即使用ActiCHO P Powder CD基礎(chǔ)培養(yǎng)基CD Efficient Feed C AG補料培養(yǎng)基,并添加Sheff-CHO Plus PF ACF。共進行三個批次的發(fā)酵實驗,培養(yǎng)14 d后VEGF-MA產(chǎn)量均在3.20 g/L左右(圖4),且VEGF-MA電荷異質(zhì)性、糖基化水平和蛋白純度均達到質(zhì)量標準(表7)。在后續(xù)的研究中,將以這三個批次作為對照,在3 L發(fā)酵罐中對接種密度、pH、溶解氧濃度(DO)、前期培養(yǎng)溫度和后期培養(yǎng)溫度做進一步優(yōu)化。

        圖4 最優(yōu)培養(yǎng)基配比條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        表7 最優(yōu)培養(yǎng)基配比條件下的VEGF-MA質(zhì)量

        首先優(yōu)化接種密度,分別考察0.7×106個/mL、1.0×106個/mL和1.3×106個/mL三個接種密度條件下的VEGF-MA生產(chǎn)性能,VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量和分別如圖5和表8所示??梢钥闯鼋臃N密度對VEGF-MA產(chǎn)量、電荷 異質(zhì)性、糖基化水平和VEGF-MA純度均沒有顯著影響。因此,在后續(xù)研究中,仍然使用1.0×106個/mL的接種密度。

        圖5 不同接種密度條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        表8 不同接種密度條件下的VEGF-MA質(zhì)量

        2.2.2pH優(yōu)化

        對細胞培養(yǎng)過程中的pH進行優(yōu)化,分別考察pH設(shè)定為7.00(對照)、7.10和7.15條件下的VEGF-MA生產(chǎn)性能,VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量和分別如圖6和表9所示。pH設(shè)定為7.10時VEGF-MA產(chǎn)量最高,達到表達量3.70 g/L。此時的電荷異質(zhì)性、糖基化水平和VEGF-MA均處在標準的范圍內(nèi)。因此,在后續(xù)的研究中都將選用7.10作為pH的設(shè)定值。

        圖6 不同pH條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        表9 不同pH條件下的VEGF-MA質(zhì)量

        2.2.3DO優(yōu)化

        對細胞培養(yǎng)過程中的DO進行優(yōu)化,分別考察DO為20%(對照)、40%和80%條件下的VEGF-MA生產(chǎn)性能,VEGF-MA產(chǎn)量和質(zhì)量和分別如圖7和表10所示。從中可以看出,DO對VEGF-MA產(chǎn)量、蛋白異質(zhì)性和糖基化水平并無顯著影響,但DO為40%時VEGF-MA純度最高。因此,在后續(xù)的研究中,均使用40%的DO水平。

        圖7 不同DO條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        表10 不同DO條件下的VEGF-MA質(zhì)量

        2.2.4前期培養(yǎng)溫度優(yōu)化

        在培養(yǎng)CHO細胞表達目的蛋白的過程中,培養(yǎng)前期通常采用較高的溫度,而在培養(yǎng)后期適當(dāng)降溫,本研究首先對培養(yǎng)前期的溫度進行優(yōu)化。考察培養(yǎng)前期溫度分別為36.0 ℃(對照)、36.5 ℃和37.0 ℃條件下VEGF-MA的生產(chǎn)性能,結(jié)果如圖8和表11所示。36.5 ℃條件下,VEGF-MA濃度和純度分別為3.26 g/L和96.6%,均高于其他兩個批次。因此,在后續(xù)的研究中將繼續(xù)采用36.5 ℃的前期培養(yǎng)溫度。

        圖8 不同前期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        表11 不同前期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA質(zhì)量

        2.2.5后期培養(yǎng)溫度優(yōu)化

        對培養(yǎng)后期的溫度進行優(yōu)化??疾炫囵B(yǎng)后期溫度分別為32.0 ℃、33.0 ℃(對照)和34.0 ℃條件下VEGF-MA的生產(chǎn)性能,結(jié)果如圖9和表12所示。后期培養(yǎng)溫度為34.0 ℃時能夠獲得最高的VEGF-MA產(chǎn)量(4.10 g/L),而此時的VEGF-MA質(zhì)量也能達到標準。因此可以確定,最佳的后期培養(yǎng)溫度為34.0 ℃。

        圖9 不同后期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA產(chǎn)量

        表12 不同后期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA質(zhì)量

        3 結(jié)論

        (1) 培養(yǎng)重組CHO細胞生產(chǎn)VEGF-MA的最優(yōu)基礎(chǔ)培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基和外源添加物分別為ActiCHO P Powder CD、CD Efficient Feed C AG和Sheff-CHO Plus PF ACF。在此條件下的VEGF-MA的產(chǎn)量為3.20 g/L。

        (2) 3 L發(fā)酵罐下的最優(yōu)培養(yǎng)條件:接種密度為1.0×106個/mL、pH為 7.10、溶解氧濃度為40%、前期培養(yǎng)溫度為36.5 ℃、后期培養(yǎng)溫度為34 ℃。在此條件下VEGF-MA的產(chǎn)量能夠達到4.10 g/L的較高水平,且VEGF-MA質(zhì)量較高。

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