李丹，楊鵬，滕紅麗，顏淵鴛，羅雪蘭，歐和生

血管平滑肌細胞（VSMC）是血管壁中層的主要細胞，可調(diào)節(jié)動脈血管張力并穩(wěn)定血流動力學，其凋亡參與心血管疾病進程[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是結(jié)構(gòu)復雜的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細胞生長增殖等方面起重要作用。研究表明，VSMC 凋亡時伴隨著mTOR 磷酸化水平改變[2]。微小RNA（miRNA）是一類長約18～25 個核苷酸（nt）內(nèi)源性非編碼RNA，可與靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合降解mRNA 或抑制其翻譯和表達[3]。新近研究表明，miRNA 靶向激活mTOR 信號通路升高mTOR 蛋白磷酸化水平從而降低VSMC 活性[4]。此外，miRNA可以調(diào)控凋亡相關(guān)基因上調(diào)VSMC凋亡水平，產(chǎn)生心血管保護效果[5]。27nt-miRNA 為來源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因第四內(nèi)含子中的27 堿基重復序列[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，27nt-miRNA 以增強子的方式內(nèi)源性調(diào)節(jié) eNOS 基因的轉(zhuǎn)錄效率，下調(diào)eNOS mRNA 和蛋白表達水平[7]。此外，激活eNOS表達可增強VSMC 凋亡易感性[8]。因此，本研究采用mTOR 抑制劑雷帕霉素誘導大鼠主動脈VSMC 凋亡模型，從細胞凋亡的角度探究27nt-miRNA 對VSMC 凋亡水平的調(diào)控及潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

細胞株：大鼠原代主動脈VSMC（普諾賽公司，中國）。試劑：慢病毒載體（吉凱基因有限公司，中國）；雷帕霉素（solarbio 公司，中國）；CCK-8 試劑盒（MCE 公司，中國）；膜連蛋白-別藻青單白/7-氨基放線菌素D（Annexin V-APC/7-AAD）凋亡試劑盒（聯(lián)科公司，中國）；碘化丙啶（PI/RNase）染料（BD 公司，美國）；RNA 提取試劑盒（Axygen 生物公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 熒光定量PCR 試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；兔抗mTOR、磷酸化-mTOR（p-mTOR）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）I抗及抗兔Ⅱ抗均購于美國Cell Signaling Technology 公司。PCR 引物由上海生工生物有限公司合成，序列見表1。

表1 基因及引物序列

1.2 27nt-miRNA 慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以eNOS 第四內(nèi)含子中27 堿基重復序列5'-GA AGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3'為根據(jù)，設計27nt-miRNA 高表達慢病毒顆粒LV-GV367-27ntmiRNA；同時根據(jù)其反義序列及隨機對照序列構(gòu)建LVGV367-anti-27nt-miRNA 和LV-GV367-NC?？?采 用qRT-PCR 法驗證轉(zhuǎn)染細胞株是否穩(wěn)定表達目的基因。

1.3 大鼠原代主動脈VSMC 轉(zhuǎn)染與分組

取對數(shù)生長期的細胞，3 種慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染細胞，細胞分為五組：空白對照組、雷帕霉素組、27nt-miRNA 組、27nt-miRNA反義序列（anti-27ntmiRNA）組、陰性對照組。27nt-miRNA 組：轉(zhuǎn)染27ntmiRNA 正義鏈慢病毒載體；anti-27nt-miRNA 組：轉(zhuǎn)染27nt-miRNA 反義鏈慢病毒載體；陰性對照組：轉(zhuǎn)染隨機陰性序列慢病毒載體。除空白對照組外，其余各組細胞給予100 ng/ml 雷帕霉素培養(yǎng)2 h 誘導凋亡。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染前后VSMC 的27nt-miRNA 表達量與各組mTOR 相對表達量

采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）法提取各組的細胞總RNA，按試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和上機檢測，27nt-miRNA 檢測以U6 作為內(nèi)參，mTOR 檢測以GAPDH 為內(nèi)參，2-△△Ct表示相對表達量。上機條件：95 ℃ 10 min，40 個循環(huán)：95℃ 10 s、60℃ 60 s。

1.5 CKK-8 測定細胞毒性/增殖能力

如文獻[9]所述，步驟如下：細胞以8×103個/孔接種到96 孔板，除空白對照組外，其余各組細胞給予100 ng/ml 雷帕霉素培養(yǎng)2 h 誘導凋亡。然后每孔加入110 μl 新配制CCK-8 液（含CCK-8 液10 μl），37℃避光孵育1 h，酶標儀450 nm 波長測定吸光度值（A450 nm）。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

如文獻[10]中所述，步驟如下：收集各組細胞，取適量Binding Buffer（1×）重懸并調(diào)節(jié)細胞密度至5×105/ml，取100 μl 細胞懸液置于流式管中，加入5 μl Annexin V-APC 和10 μl 7-AAD，室溫避光孵育15 min，加入400 μl Binding Buffer（1×），上機檢測。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期

按照文獻[11]所述，方法如下：收集各組細胞，加入預冷的70%酒精4℃固定過夜。次日棄掉固定液，取500 μl PI/RNase 染料混懸細胞，避光孵育30 min，上機檢測。

1.8 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測各基因的蛋白表達量

收集各組細胞并裂解提取總蛋白。分別取各組總蛋白40 μg 進行SDS-PAGE 電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。封閉1 h 后加入mTOR、p-mTOR、Bcl-2、Bax和caspase-3的I抗（稀釋比例1：1000），4℃孵育過夜，次日加入熒光Ⅱ抗（稀釋比例1：10 000）避光孵育1 h。雙色熒光掃描成像系統(tǒng)分析蛋白電泳條帶的灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/對照組灰度值。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗重復3 次，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素ANOVA 方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建27nt-miRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染VSMC 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，27nt-miRNA 組的27nt-miRNA 表達水平顯著升高9.45±2.90，同時也高于anti-27nt-miRNA 組和陰性對照組（P均＜0.05）。與此同時，anti-27nt-miRNA組的27nt-miRNA 相對表達量為0.44±0.09，較空白對照組降低了55.3%（P＜0.05），且低于27ntmiRNA 組和陰性對照組（P均＜0.05）。而陰性對照組的27nt-miRNA 表達量與正常對照組無組間差異。

2.2 27nt-miRNA 過表達增強VSMC 細胞活力（圖1）

CCK-8 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，雷帕霉素組細胞A450 nm 值降低了31.3%（1.15±0.06 vs 0.79±0.02，P＜0.05），與27nt-miRNA 組A450 nm 值比較差異無統(tǒng)計學意義；與陰性對照組相比，27ntmiRNA 組細胞A450 nm 值增加55.26%（0.76±0.02 vs 1.18±0.04，P＜0.05）；anti-27nt-miRNA 組 細 胞A450 nm 值較其他組均顯著降低（P＜0.05）。

圖1 CCK-8 檢測各組大鼠主動脈VSMC 的A450 nm 值（±s）

2.3 27nt-miRNA 過表達抑制VSMC 凋亡（圖2）

流式細胞儀的散點圖（圖2A）右下Q3 象限為早凋細胞（APC+，7-AAD-），右上Q2 象限是晚期凋亡細胞（APC+，7-AAD+）。結(jié)果顯示，雷帕霉素組細胞早期與晚期凋亡率顯著高于空白對照組[早期：（17.56±0.56）% vs（3.63±1.11）%,晚期：（4.75±0.20）% vs（2.26±0.25）%，P均＜0.05]，其與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。27ntmiRNA 組細胞早期凋亡率與晚期凋亡率均低于陰性對照組[早期：（5.28±0.31）% vs（14.68±1.36）%，晚 期：（3.14±0.18）% vs（4.96±0.16）%，P＜0.05]，而anti-27nt-miRNA 組早期與晚期凋亡率均高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

2.4 27nt-miRNA 過表達抑制VSMC 細胞周期G1 期分裂進程（圖3）

圖2 流式細胞儀檢測各組大鼠主動脈VSMC 的凋亡率（±s，n=3）

圖3 流式細胞儀檢測各組大鼠主動脈VSMC 的細胞周期分布（±s，n=3）

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，雷帕霉素誘導細胞發(fā)生凋亡時細胞周期阻滯在G1 期（DNA 合成前期），雷帕霉素組G1 期（DNA 合成前期）細胞比例高于空白對照組，S 期（DNA 合成期）的細胞比例低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義[G1 期：（82.37±1.47）%vs（72.53±2.44）%，S 期：（4.03±1.40）% vs（13.10±2.03）%，P均＜0.05]。陰性對照組與雷帕霉素組在上述指標的比較無顯著差異。與陰性對照組比較，27nt-miRNA 組G1 期細胞比例呈降低趨勢且S 期占比較高，組間差異均有統(tǒng)計學意義[G1 期：（75.37±2.14）% vs（82.99±2.13）%，S 期：（8.22±1.93）% vs（4.77±1.03）%，P均＜0.05]，此外27nt-miRNA 組各細胞周期分布與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義；anti-27nt-miRNA 組的G1 期細胞比陰性對照組高3.55%，S 期細胞比例比陰性對照組低80.71%，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

2.5 27nt-miRNA 過表達調(diào)控促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的表達（圖4）

Western blot 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，雷帕霉素組的Bax 和caspase-3 表達水平呈升高趨勢而Bcl-2 表達水平呈下降趨勢（P均＜0.05），雷帕霉素組與陰性對照組間蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義。與陰性對照組比較，27nt-miRNA 組Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高，同時Bax 和caspase-3 蛋白表達水平均降低（P均＜0.05）；而anti-27nt-miRNA 組中各凋亡蛋白表達趨勢與27nt-miRNA 組相反（P＜0.05）。

圖4 Western blot 法比較各組大鼠主動脈VSMC 的Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達水平（±s，n=3）

2.6 27nt-miRNA 過表達可抑制mTOR 基因轉(zhuǎn)錄與蛋白磷酸化（圖5）

qRT-PCR 與Western blot 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，雷帕霉素組的p-mTOR 蛋白表達水平與mTOR mRNA 表達水平均呈下降趨勢（P均＜0.05），雷帕霉素組與陰性對照組在上述指標的差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。與陰性對照組比較，27ntmiRNA 組mTOR mRNA 相對表達水平與p-mTOR蛋白表達水平均降低（P均＜0.05），而anti-27ntmiRNA 組中表達趨勢則相反（P＜0.05）。

圖5 Western blot 法比較各組大鼠主動脈VSMC 的p-mTOR/mTOR 蛋白水平的比值以及qRT-PCR 比較mTOR mRNA相對表達水平（±s，n=3）

3 討論

VSMC 是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)的主要細胞類型，可協(xié)調(diào)血管壁的彈性與張力并保持血流動力學穩(wěn)定[1]。VSMC 異常增殖和遷移是心血管疾病的關(guān)鍵事件，研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣斑塊區(qū)域有VSMC 異常增殖[12]。研究表明，miRNA 可調(diào)控VSMC 凋亡、侵襲和遷移，如miR-574-5p 通過抑制ZDHHC14 基因表達促進細胞增殖并抑制凋亡[13]。27nt-miRNA是來源于內(nèi)皮源性eNOS 基因第四內(nèi)含子中的 27堿基重復序列，本課題組的前期研究表明，27ntmiRNA 參與VSMC 收縮型的特異性平滑肌22α 基因（SM22α）調(diào)控，并抑制血管內(nèi)皮細胞eNOS 基因表達及一氧化氮產(chǎn)物的合成[14]。在本研究中，我們構(gòu)建了27nt-miRNA 過表達與反義序列慢病毒載體轉(zhuǎn)染VSMC 并采用雷帕霉素誘導凋亡，CCK-8 法結(jié)果顯示27nt-miRNA 過表達可增強VSMC 細胞活性，流式細胞術(shù)進一步顯示細胞凋亡率顯著降低且減弱細胞分裂周期G1 期阻滯。以上結(jié)果提示27ntmiRNA 可能參與調(diào)控VSMC 凋亡生理過程，那么該內(nèi)含子源性miRNA 是否通過抑制與細胞凋亡有關(guān)的生長因子表達進而抑制了VSMC 的凋亡？

抗凋亡蛋白Bcl-2 通過抑制細胞色素C 的釋放維持線粒體外膜完整性；而促凋亡蛋白Bax 增加線粒體外膜的通透性促進細胞色素C 進入細胞質(zhì)[15]；半胱氨酸依賴性內(nèi)切蛋白酶家族的caspase-3 是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應中的下游關(guān)鍵蛋白[16]。mTOR 是由2 549 個氨基酸殘基構(gòu)成的絲/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸肌醇-3-激酶相關(guān)激酶家族和絲氨酸/蘇氨酸激酶信號傳導，調(diào)控細胞凋亡以及細胞周期和蛋白質(zhì)合成等功能[17]。大量研究表明[18-19]，內(nèi)源性的miRNA 對mTOR 分子信號調(diào)節(jié)參與了VSMC的增殖、凋亡和衰老等細胞功能。例如，Lee 等[20]在研究發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p 可直接靶向mTOR 信號通路中負調(diào)節(jié)因子的3'-UTR 促進細胞增殖。我們的研究進一步提示，當雷帕霉素誘導經(jīng)27nt-miRNA轉(zhuǎn)染的VSMC 發(fā)生凋亡時，27nt-miRNA 可負調(diào)控mTOR 基因轉(zhuǎn)錄與蛋白磷酸化水平，促凋亡蛋白Bax 與caspase-3 表達受抑制而抗凋亡蛋白Bcl-2 表達上調(diào)，這可能是27nt-miRNA 增強VSMC 抗凋亡能力的潛在機制之一。

綜上，本研究提出27nt-miRNA 抑制mTOR 介導的主動脈VSMC 凋亡，其機制可能與靶向負調(diào)控mTOR 基因轉(zhuǎn)錄水平與蛋白磷酸化水平并下調(diào)Bax和caspase-3 表達有關(guān)。這不僅為心血管關(guān)鍵基因及其VSMC 功能學研究提供重要的理論依據(jù)，且揭示了27nt-miRNA 與心血管疾病關(guān)鍵信號因子之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)及其潛在的臨床應用。