石舉然，李麗杰*，張曾亮，王 敏，盧 賽，楊 迪，王魯慧，鄒圣燦

1頤海產(chǎn)業(yè)控股有限公司，青島 266100；2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院，呼和浩特 010110

機體免疫功能是一個與衰老有密切關(guān)系的因素，一般在30歲左右開始減退，這種變化是悄然、緩慢、持續(xù)進行的，生活節(jié)奏加快與競爭壓力增大加劇了這個變化趨勢。因此，增強免疫功能產(chǎn)品的開發(fā)顯得尤為重要。增強免疫功能的產(chǎn)品原料來源廣泛，其中海洋資源及天然植物提取物效果良好但開發(fā)利用程度較低，如魚皮膠原蛋白肽[1]、殼寡糖[2]、人參[3]、黃芪[4]、當歸[5]等均具有一定的增強免疫作用，且已在相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)有所應(yīng)用。

魚皮膠原蛋白肽是魚皮膠原蛋白經(jīng)分子鏈解體、斷裂得到的一種產(chǎn)物，分子量較小，易于吸收，是一種新型來源的膠原蛋白肽，因其具有安全性好等特點，已經(jīng)成為研究熱點，但是目前其抗氧化功能研究較多，而免疫功能研究相對較少。Si等[6]研究了不同途徑給予膠原蛋白肽對小鼠免疫功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射和灌胃給予小鼠膠原蛋白肽都對小鼠免疫功能指標有顯著影響，且腹腔注射效果更加顯著。殼寡糖(COS)是殼聚糖經(jīng)酶促反應(yīng)或者化學降解得到的低聚物，聚合度2～20，是唯一帶正電荷的堿性氨基寡糖，近年來發(fā)現(xiàn)其具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多種活性[7]，聚合度為3～8的COS在體外可顯著增強原代264.7巨噬細胞的增殖活性和對中性紅細胞的吞噬能力，小鼠口服COS后脾臟指數(shù)和血清免疫球蛋白IgG含量增加[8]。Singh等[9]通過實驗研究表明，人參具有增強小鼠免疫力的作用，在特異性抗體形成、淋巴細胞增殖及巨噬細胞吞噬能力增強等多方面均有所體現(xiàn)。黃芪多糖(APS)是黃芪發(fā)揮效應(yīng)的主要成分，經(jīng)體內(nèi)代謝后分解為單糖或低聚糖，生物學功能呈現(xiàn)多樣性，具有增強機體免疫、提高抗氧化能力、抗炎癥等多種藥理學作用，APS已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)藥領(lǐng)域[10]。Zhou等[4]研究表明，黃芪多糖能通過促進機體免疫器官發(fā)育和增強T細胞、B細胞及自然殺傷細胞等免疫細胞的功能來提高動物細胞免疫和體液免疫水平。當歸為甘肅道地藥材，現(xiàn)代藥理研究表明，當歸具有補血活血、調(diào)節(jié)機體免疫、抗衰老、改善肝功能等生理作用[11]。文獻報道百分之五的當歸多糖可顯著增強小鼠腹腔細胞對雞紅細胞(CRBC)的吞噬功能對小鼠腹腔細胞吞噬功能的抑制作用[12]。

現(xiàn)代免疫理論認為，人體的免疫力是免疫器官、免疫細胞及細胞因子共同作用的結(jié)果，而不同生物活性物質(zhì)的作用機理也各不相同，魚皮膠原蛋白肽能夠調(diào)節(jié)免疫相關(guān)活性指標[6]，殼寡糖[8]、當歸[12]可以增強巨噬細胞吞噬能力，人參多糖能夠促進特異性抗體形成[9]，而黃芪能夠促進免疫器官發(fā)育[10]，不同原料作用于不同靶點，在提高免疫方面起到協(xié)同作用，因此調(diào)節(jié)機體免疫力也應(yīng)該從多種方面考慮。目前關(guān)于調(diào)節(jié)機體免疫方面的研究多集中在植物提取物的復配上，未見海洋活性物質(zhì)與植物提取物配伍并應(yīng)用在調(diào)節(jié)動物免疫方面的研究，本研究自制了分子量為2 000～3 000 Da的魚皮膠原蛋白肽，同時與殼寡糖、人參提取物、黃芪提取物和當歸提取物進行復配，研究復方制品對免疫調(diào)節(jié)的效果，為海洋生物資源與天然植物提取物配伍開發(fā)產(chǎn)品，并應(yīng)用在免疫調(diào)節(jié)方面提供一定的理論支持。

1 儀器與試劑

SPECTRAMAX plus酶標儀(北京龍躍生物科技有限公司)、PL203型電子天平(上海速展機電有限公司)、CO2-80A-IR CO2培養(yǎng)箱(上海丙林電子科技有限公司)、HHS-21-8振蕩水浴槽(上海添時科學儀器有限公司)、TDL-4高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)、XSP-2CA顯微鏡(上海光學儀器一廠)、24孔和96孔細胞培養(yǎng)板(上海古朵生物科技有限公司)等。

SRBC(北京博爾西科技有限公司)、補體(豚鼠血清)(北京博爾西科技有限公司)、Hanks液(武漢卡諾斯科技有限公司)、SA緩沖液(上海晶抗生物工程有限公司)、印度墨汁(南京杜萊生物技術(shù)有限公司)、都氏試劑(上海羽朵生物科技)、YAC-1細胞(南京科佰生物科技有限公司)、RPMI1640完全培養(yǎng)液(上海圻明生物科技有限公司)、Giemsa染色液(上海哥凡生物科技有限公司)等。

2 受試藥物

殼寡糖購自山東衛(wèi)康生物醫(yī)藥有限公司；人參提取物(10∶1，人參皂苷5%，批號NW17052201)、黃芪提取物(10∶1，黃芪甲苷0.8%，批號NW17040503)、當歸提取物(10∶1，阿魏酸0.08%，批號NW17051801)購自威海松齡諾可佳中藥飲片有限公司；清潔級全價鼠顆粒飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

魚皮膠原蛋白肽：自制，以鱈魚皮為材料，選用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶同步酶解，獲得分子量為2 000～3 000 Da的肽段產(chǎn)品，其溶解性好，易吸收。

魚皮膠原蛋白肽復方制品：將自制的魚皮膠原蛋白肽與殼寡糖、人參提取物、黃芪提取物、當歸提取物按照230∶5∶12∶30∶42比例復配而成。

3 動物分組與飼養(yǎng)

3.1 實驗動物與飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級健康ICR雌性小鼠，體重18～22 g，共336只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境為屏障環(huán)境，實驗環(huán)境溫度20～22 ℃，相對濕度45%～65%。

3.2 動物分組

實驗前小鼠在動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后開始正式實驗。小鼠隨機分為4批(N = 84)，第一批進行臟器/體重比值、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、抗體生成細胞檢測及血清溶血素測定；第二批進行碳廓清實驗；第三批進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗；第四批進行ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗和NK細胞活性測定實驗。將每批的84只小鼠隨機分為7組，每組12只，其中1組作為陰性對照組，3組為復方制品低、中、高劑量組，另外3組為魚皮膠原蛋白肽低、中、高劑量組。

3.3 受試物劑量選擇與給予方式

復方制品和魚皮膠原蛋白肽設(shè)置的3個劑量組分別為低(0.5 g/kg)、中(1.0 g/kg)、高(3.0 g/kg)劑量組，分別相當于人體推薦攝入量的5、10、30倍。以純化水為溶劑將受試物分別配至所需濃度，即分別稱取1、2、6 g受試物用純化水定容至40 mL，同時設(shè)立陰性對照組灌胃純化水，按每天0.2 mL/10 g連續(xù)灌胃30天，測試各項功能指標。

4 實驗方法

4.1 小鼠體重及臟器/體重比值測定

小鼠在初始(給藥前)、中期(給藥15天)、末期(給藥30天)分別稱重，記錄各組體重的平均值。腹腔注射SRBC 5天后處死動物，取胸腺、脾臟稱重，計算臟器/體重比值。

4.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)-足跖增厚法[13]

小鼠腹腔注射2%(V/V)SRBC，致敏后4天測量左后足跖厚度，然后在測量部位皮下注射20%(V/V)SRBC，每鼠注射20 μL，注射后24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值。以攻擊前后足跖厚度差值來表示DTH的程度。

4.3 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗(MTT法)[14]

無菌取脾，制備脾細胞懸液，用Hanks液洗2次，每次離心10 min(1 000 rpm)，將細胞懸浮于1 mL RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度為3×106個/mL。細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加入75 μL ConA 液，另一孔作為對照，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，同時加入MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻使紫色結(jié)晶完全溶解，在570 nm波長處測定OD值，以加Con A 孔的OD值減去不加ConA的OD值表示淋巴細胞增殖能力。

4.4 血清溶血素測定[15]

小鼠腹腔注射SRBC 5天后，摘眼球取血，離心取血清稀釋100倍，進行半數(shù)溶血值測定。同時制備脾細胞懸液，進行抗體生成細胞測定。

4.5 抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法)[16]

取脾制成細胞懸液。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后與等量雙倍Hanks液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內(nèi)加50 μL 10%(V/V)SRBC(使用SA液配制)、25 μL脾細胞懸液，迅速混勻后，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在玻片架上，放入CO2培養(yǎng)箱溫育1.5 h，然后用SA液稀釋的補體(1∶8)加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5 h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

4.6 小鼠碳廓清試驗[17]

小鼠尾靜脈注射1∶3稀釋的印度墨汁，待墨汁注入立即計時，注入墨汁后2和10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并將其加到2 mL NaCO3溶液中，在600 nm波長處測OD值。將小鼠處死，取肝和脾臟稱重，計算吞噬指數(shù)。

4.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗[17]

小鼠腹腔注射20%(V/V)雞紅細胞懸液1 mL，間隔0.5 h處死，固定于鼠板上，剪開腹壁皮膚，注射生理鹽水2 mL，轉(zhuǎn)動鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，分滴于2片玻片上，37 ℃溫育30 min，用生理鹽水漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，Giemsa染液染色10 min，用純化水漂洗晾干，用油鏡鏡檢，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。

4.8 NK細胞活性測定[15]

實驗前24 h將靶細胞傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL。小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，制備脾細胞懸液，用Hanks液洗2次，每次離心10 min(1 000 rpm)。棄上清將細胞漿彈起，加入0.5 mL滅菌水裂解紅細胞，20 s后再加入0.5 mL 2倍Hanks液及8 mL Hanks液，離心10 min(1 000 rpm)，用1 mL含10%(V/V)小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL，將靶細胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，試驗孔加入100 μL脾細胞(效靶比50∶1)，自然釋放孔加入100 μL培養(yǎng)液，最大釋放孔加入100 μL 1%(V/V) NP40，37 ℃培養(yǎng)4 h。離心，取上清100 μL置于96孔酶標板中，加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)3 min，以1 mol/L的HCl終止反應(yīng)，在酶標儀490 nm處測定OD值。

5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，采用方差分析，先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法(Dunnett檢驗法)進行統(tǒng)計分析；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。

6 結(jié)果

6.1 受試物對小鼠體重的影響

分別測定各組實驗小鼠的初始體重、中期體重和末期體重，并計算小鼠增重，由表1可知，在30天喂養(yǎng)試驗過程中，魚皮膠原蛋白肽和復方制品各劑量組小鼠各個階段的體重及最終的體重增加值與陰性對照組相比均無顯著差異(P>0.05)，說明受試物喂養(yǎng)對小鼠增重沒有影響。

表1 受試物對小鼠體重的影響

6.2 受試物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DHT)的影響

由表2可知，魚皮膠原蛋白肽和復方制品各劑量組小鼠的足跖腫脹度與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，說明這兩種受試物不會引起小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。

表2 受試物對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DHT)的影響

6.3 受試物對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗的影響

由表3可知，與陰性對照組比較，復方制品組和魚皮膠原蛋白肽組的低、中、高劑量組小鼠的脾淋巴細胞增殖能力存在極顯著性差異(P<0.01)，說明復方制品和魚皮膠原蛋白肽在低、中、高劑量下都有增加脾細胞增殖的能力，復方制品組小鼠淋巴細胞增殖能力更強，說明魚皮膠原蛋白肽與其他生物活性成分按照合適比例復配之后效果更佳。

表3 受試物對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗的影響

6.4 受試物對小鼠臟器/體重比值的影響

由表4可知，與陰性對照組相比，復方制品和魚皮膠原蛋白肽的各劑量組小鼠的脾臟/體重比值和胸腺/體重比值無顯著性差異(P>0.05)，說明兩種受試物喂養(yǎng)對于小鼠臟器均沒有影響。

表4 受試物對小鼠臟器/體重比值的影響

6.5 受試物對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響

由表5可知，與陰性對照組相比，復方制品和魚皮膠原蛋白肽各劑量組小鼠的抗體生成細胞數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，說明兩種受試物對于小鼠抗體形成細胞的增殖沒有影響。

表5 受試物對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響

6.6 受試物對小鼠血清溶血素的影響

由表6可知，復方制品組的低劑量組小鼠血清溶血素水平與陰性對照組相比，無顯著差異(P>0.05)；中、高劑量組小鼠的血清溶血素水平與陰性對照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。魚皮膠原蛋白肽組中、低劑量組小鼠血清溶血素水平與陰性對照組相比，無顯著差異(P>0.05)；高劑量組小鼠的血清溶血素水平與陰性對照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。說明一定劑量的復方制品和魚皮膠原蛋白肽均可以增加小鼠血清溶血素水平，增強小鼠免疫。相比于魚皮膠原蛋白肽組，復方制品組達到相同效果所需要的劑量更小。

表6 受試物對小鼠血清溶血素的影響

6.7 受試物對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清能力的影響

由表7可知，復方制品組的高劑量組與陰性對照組比較，小鼠的單核-巨噬細胞碳廓清吞噬指數(shù)明顯增高，有顯著性差異(P<0.05)；而魚皮膠原蛋白肽各個劑量組與對照組相比，均無顯著性差異(P<0.05)，說明一定劑量的魚皮膠原蛋白肽復方制品能顯著提高小鼠的單核-巨噬細胞碳廓清吞噬指數(shù)。

6.8 受試物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

由表8可知，復方制品和魚皮膠原蛋白肽高劑量組小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬百分率與陰性對照組比較，均有極顯著性差異(P<0.01)，說明兩種受試物的各個劑量組對于提高小鼠巨噬細胞吞噬作用均有顯著作用，且隨著劑量的增強效果增強。從表中數(shù)據(jù)可以看出，相同劑量的復方制品組效果優(yōu)于魚皮膠原蛋白肽組。

6.6 受試物對小鼠NK細胞活性的影響

由表9可知，復方制品組的中、高劑量組小鼠的NK細胞活性與陰性對照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。魚皮膠原蛋白肽組的高劑量組與陰性對照組相比，有極顯著性差異(P<0.01)，說明一定劑量的復方制品和魚皮膠原蛋白均能夠增強小鼠NK細胞活性，且復方制品組效果要優(yōu)于魚皮膠原蛋白肽組。

表7 受試物對小鼠單核-巨噬細胞碳廓清能力的影響

表8 受試物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

表9 受試物對小鼠NK細胞活性的影響

通過灌胃給予小鼠不同劑量的魚皮膠原蛋白肽和魚皮膠原蛋白肽復方制品，探究兩者是否具有增強免疫力功能。結(jié)果表明，魚皮膠原蛋白肽及其復方制品均能提高小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力和血清溶血素水平，具有促進單核-巨細胞碳廓清的能力，能夠提高腹腔巨噬細胞吞噬百分率和促進NK細胞活性，而且，在提高淋巴細胞增殖能力、增強NK細胞活性等方面，相同劑量的復方制品較單一的魚皮膠原蛋白肽效果更好；兩種受試物對小鼠的足距腫脹度、抗體生成細胞數(shù)、腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)、脾臟/體重比值、胸腺/體重比值無顯著影響。因此，魚皮膠原蛋白肽與殼寡糖、人參提取物、黃芪提取物、當歸提取物按照一定比例復配后的復方制品能夠提高小鼠免疫力，且效果優(yōu)于單一的魚皮膠原蛋白肽。

7 討論

我國是擁有豐富魚類資源的海洋國家，近年來，海洋資源的開發(fā)與利用成為研究的熱點。深海魚膠原蛋白肽因具有來源廣、低抗原性、低過敏性和使用安全等特點[18]逐漸替代了傳統(tǒng)的膠原蛋白，成為一種海洋來源新型膠原蛋白資源。受制備技術(shù)的限制，目前的海洋肽類通常是非常復雜的混合物，分子量范圍較為寬泛，特定分子段活性肽的制備已成為其工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸，影響了活性肽的構(gòu)效關(guān)系和相關(guān)活性機制及應(yīng)用研究[19]。同時，在應(yīng)用方面，目前對于單一魚皮膠原蛋白肽抗氧化等活性的研究較多，而以其為原料復配天然提取物開發(fā)增強免疫功能食品的研究很少。

本研究以深海鱈魚皮為原料，采用復合酶同步水解法高效制備了分子量為2 000～3 000 Da的魚皮膠原蛋白肽，將其按照一定比例與殼寡糖、人參提取物等復配得到一種增強免疫的復方制品，進行該膠原蛋白肽及其復方制品在增強免疫效果方面的研究，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的提高免疫效果，且與天然提取物原料復配之后效果更加明顯，這可能是因為不同分子量的魚皮膠原蛋白肽特定的活性功能，2 000～3 000 Da顯示出較好的增強免疫功能，而且與天然提取物復配之后，其中的有效成分在增強機體免疫方面具有協(xié)同作用。特定分子量魚皮膠原蛋白肽不僅安全性高、具有不同的生物活性[20]，而且解決了海洋漁業(yè)資源在利用過程中資源浪費的問題，同時海洋資源與天然植物提取物的組合應(yīng)用也為其他功能食品的開發(fā)提供了一條新的途徑。