李 珍，叢媛媛，阿依江·哈拜克，帕麗達·阿不力孜

新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 是一種發(fā)生于老年期或老年前期的以進行性認知功能減退為典型表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，同時伴有精神行為異常、人格障礙等臨床癥狀。近年來，對于阿爾茨海默病流行病學和基因學的研究，進一步闡明了其致病因素、遺傳的復雜性以及病理變化[1,2]。AD典型臨床特征主要是神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)和老年斑(senile plaque，SP)，其重要病理變化主要有兩方面：β淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)以及高度磷酸化Tau蛋白共同構成的神經(jīng)纖維纏結NFTs。神經(jīng)纖維纏結的主要成分是微管相關蛋白Tau。AD患者腦中Tau蛋白過度磷酸化導致其與微管結合能力降低，磷酸化的Tau蛋白聚集形成細胞內的神經(jīng)纖維纏結，干擾神經(jīng)元的正常功能，并最終導致神經(jīng)元的變性與死亡[3,4]。

阿里紅為多孔菌科大型真菌阿里紅(FomesofficinalisAmes)的子實體，主要分布在我國西北和東北，其中在新疆主要分布于阿勒泰地區(qū)。阿里紅多糖是阿里紅中除三萜酸、甾醇類、黃酮類等之外的又一重要生物活性物質，具有免疫調節(jié)及抗衰老活性作用[5]。前期研究已證實，阿里紅多糖在傳統(tǒng)方法構建的AD模型中均表現(xiàn)出明顯的拮抗AD作用，具有一定的防治神經(jīng)退行性疾病的作用[6]。阿里紅多糖組分FOPS-a、FOPS-b是經(jīng)過阿里紅粗多糖純化后得到的兩個組分[7]，目前尚未見有關FOPS-a和FOPS-b抗AD的文獻報道。本試驗擬以FOPS-a、FOPS-b為研究對象，應用APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠[8,9]，采用跳臺、曠場實驗、尼氏染色法、RT-PCR、Western-blot等實驗手段，從行為學、組織病理學、分子生物學角度初步探討阿里紅多糖組分FOPS-a和FOPS-b對APP/PS1雙轉基因小鼠腦部海馬區(qū)AKT/GSK3β/Tau/P-tau蛋白表達的影響，為阿里紅多糖類成分防治AD的作用提供參考數(shù)據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

阿里紅多糖組分FOPS-a與FOPS-b由課題組自制；鹽酸多奈哌齊(批號1704021，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司)；Total RNA提取試劑(批號AI21584A，日本TAKARA公司)、熒光定量試劑(批號AJ11523A，日本TAKARA公司)、逆轉錄試劑(批號AJ12435A)，日本TAKARA公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號20181218，北京索萊寶有限公司)。20×TBST(批號20190605，北京索萊寶有限公司)；脫脂奶粉(批號EZ3456D330，)；吐溫20(批號308P013， 北京索萊寶有限公司)。AKT兔抗單克隆抗體(批號GR3235334-3，abcam公司)；GSK3β兔抗單克隆抗體(批號GR312697-15，abcam公司)；Tau兔抗單克隆抗體(批號GR64/32-4，abcam公司)；P-tau兔抗單克隆抗體(批號GR303639-20，abcam公司)；HRP 標記山羊抗兔二抗(批號 20190321，CST公司)。

1.2 動物

64只APP/PS1雙轉基因小鼠，雄性，3月齡，體重25±5 g，購買于北京華阜康實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。同月齡同背景的C57BL/6J小鼠8只，購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，使用許可證編號：SYXK(新)2016-0002。小鼠全部飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心SPF級動物房4-6室，單籠單只飼養(yǎng)，每周換一次墊料和水。室溫20-25℃，濕度40%-60%，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗，實驗過程中動物自由攝食與飲水。

1.3 儀器

DT-200小鼠跳臺測試儀(成都泰盟科技有限公司)；OFT-100大小鼠開場活動實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；TP-114電子天平(北京Sartorius公司)；勻漿機(上海博訊公司)；低溫冷凍高速離心機(美國Thermo Scientific公司)，全波長酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國thermo公司)；RM2016病理切片機(德國Leica公司)；凝膠電泳及轉膜設備(美國BIO-RAD公司)；DM4000熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

64只APP/PS1 雙轉基因小鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組(每日灌胃劑量為0.65 mg/kg)、阿里紅多糖組分(FOPS-a和FOPS-b)高、中、低劑量組(每日灌胃劑量分別為60、30、15 mg/kg)每組8只。8只C57BL/6J小鼠作為正常對照組，模型組和正常對照組給予等體積的生理鹽水灌胃。與3月齡時對各組小鼠實施灌胃治療，每天上午灌胃1次，連續(xù)灌胃90天。

2.2 跳臺行為學實驗

小鼠跳臺裝置為一個長方形反射箱，大小為 20 cm×20 cm×30 cm，用黑色塑料板分隔成為6間。底面鋪以間距為5 mm可通交流電的銅柵。每間左后放置一高3.2 cm、直徑4.5 cm的絕緣橡膠站臺[10,11]。小鼠位于站臺上可免受電擊，當小鼠跳下站臺時，則遭受到 24 V電擊刺激。本實驗連續(xù)進行兩天，第一天為適應學習階段，首先將小鼠放入跳箱中熟悉周圍環(huán)境自由活動3 min，隨后通24 V的交流電，持續(xù)5 min。小鼠受到電擊后其正常反應是跳上站臺以躲避傷害性刺激，多數(shù)動物可能會再次或多次跳至網(wǎng)柵上，受到電擊后又迅速跳回站臺。記錄每只小鼠第一次跳下站臺的時間(即潛伏期)和受到電擊的次數(shù)(即錯誤次數(shù))。第2天為實驗階段，即記憶保持階段。(實驗前無需再適應)直接將小鼠放置于站臺上，同時通電觀察，記錄小鼠第一次跳下站臺的潛伏期和5 min內的錯誤次數(shù)。

2.3 曠場實驗

曠場實驗以實驗動物在新奇的環(huán)境中某些行為學的發(fā)生頻率和持續(xù)時間為指標，反應實驗動物在陌生環(huán)境中的自主和探究行為[12,13]。曠場實驗裝置為長50 cm，寬50 cm，高40 cm的實驗箱，箱底部由外向內化分為邊緣區(qū)、中間區(qū)、中心區(qū)三部分：邊緣區(qū)距離曠場邊緣8 cm，中心區(qū)占總區(qū)域面積的16%，剩余為中間區(qū)。攝像頭置于中心區(qū)正上方。實驗時將小鼠背靠箱壁投放于固定邊緣區(qū)，實驗人員遠離曠場箱，小鼠自主活動同時進行攝像5 min。記錄小鼠在曠場中的站立次數(shù)(即兩前肢離地1 cm的次數(shù))，水平運動距離。實驗室保持安靜，光線均勻。

2.4 腦組織取材及石蠟包埋

行為學實驗結束后，使用10%水合氯醛麻醉小鼠將其固定在泡沫板上。用消毒后鑷子和小剪刀打開胸腔暴露出心臟和肝臟，先用裝有生理鹽水注射器的針頭小心插入小鼠左心室進行灌注，同時去除肝臟使血液流出，待小鼠舌頭變白再用4%多聚甲醛灌流固定完全后迅速取出全腦。在冰袋上分離左右腦，一半腦浸在甲醛固定液中，一半腦分離出海馬放入凍存管中，液氮迅速冷凍后移入-80℃冰箱凍存，用于Western blot等分子生物學指標檢測。石蠟包埋前取出固定液中腦組織，用刀片剔除海馬區(qū)周圍多余組織，制作厚度為0.5 cm的海馬冠狀切片放入包埋盒。流水清洗30 min→蒸餾水清洗3遍(每遍3-5 min)→75%乙醇浸泡(過夜)→95%乙醇Ⅰ(1 h)→95%乙醇Ⅱ(1 h)→無水乙醇Ⅰ(1 h)→無水乙醇Ⅱ(1 h)→二甲苯透明液Ⅰ(15 min)→二甲苯透明液Ⅱ(15 min)→浸蠟Ⅰ(1 h)→浸蠟Ⅱ(1 h)。包埋后連續(xù)在海馬冠狀區(qū)切片。切下的薄片容易皺折，需放到熱水中燙平后再貼到載玻片上，置于45 ℃恒溫箱中烘干，常溫保存，用于病理學檢測。

2.5 尼氏染色

尼氏染色前需將選取的每組切片脫蠟。于45 ℃烘箱干燥1 h后，將切片放入二甲苯脫去切片中石蠟，再經(jīng)由無水乙醇(5 s)→95%乙醇Ⅰ(5 s)→95%乙醇Ⅱ(5 s)→80%乙醇(5 s)→蒸餾水清洗(3～5次)，使用尼氏染色試劑盒染色，染色后的切片由無水乙醇脫水后，再經(jīng)二甲苯透明滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封固，置光鏡下觀察[14]。

2.6 RT-PCR分析mRNA表達

自-80 ℃冰箱中取出海馬組織塊，置經(jīng)冰預冷的研缽中。按0.1 g∶1 mL 比例加入Trizol溶液，迅速研磨，將海馬粉末加入無菌的1.5 mL離心管中按試劑盒說明書操作提取。酶標儀測定經(jīng)稀釋的RNA提取物的A值和濃度、RNA的體外反轉與RT-PCR。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，擴增40個循環(huán)，以β-actin為內參[15]。

表1 引物序列

2.7 Western-blot法檢測小鼠海馬區(qū)AKT、GSK3β、Tau、P-tau蛋白表達

用鑷子取出凍存管中海馬組織并移入預冷研缽里，迅速倒入少許液氮冷凍組織成塊，按1∶5比例加入混合裂解液(RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)快速研磨組織，期間可加入2～3次液氮，保證低溫環(huán)境。直至組織全部融于裂解液中，從研缽中吸取研磨混合液至1.5 mL EP管，放入冰盒靜置15 min，使組織充分裂解。4 ℃ 12 000 rpm低溫離心30 min，取上清液按照BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白提取含量[16-18]。根據(jù)蛋白濃度按照1∶4比例加入4×上樣緩沖液(loading buffer)，加入水補充至終體積，混勻后煮蛋白(100 ℃，10 min)。冷卻室溫后放置-20 ℃冰箱保存。檢測時，經(jīng)SDS-PAGE凝膠試劑盒制膠→上樣→加入電泳液(4塊膠電泳液加滿電泳槽，2塊膠可加1/2電泳液)→放置冰盒中電泳(濃縮膠80 V，30 min，分離膠120 V，90 min)→轉膜(300 mA，70 min)→1×TBST(洗膜液)10 min，3次→脫脂牛奶封閉(2 h)→1×TBST(洗膜液)10 min，3次→一抗孵育(于4 ℃冰箱搖床上，過夜)→1×TBST(洗膜液)10 min，3次→二抗孵育(2 h)→1×TBST(洗膜液)10 min，3次→滴加顯色液→曝光(凝膠成像分析系統(tǒng)掃描)，用Image J軟件定量分析目的蛋白條帶，進行灰度分析[16]。結果以(目的蛋白灰度值/內參灰度值)×100%表示。其中AKT、GSK3β、Tau、P-tau、β-actin抗體稀釋濃度分別為1∶10 000、1∶5 000、1∶8 000、1∶8 000、1∶5 000，二抗稀釋濃度為1∶5 000。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

3 實驗結果

3.1 跳臺行為學實驗結果

各組小鼠跳臺實驗潛伏期和錯誤次數(shù)比較結果如表2所示，與模型組相比，F(xiàn)OPS-a高、中劑量組和FOPS-b高劑量組小鼠的反應期明顯縮短，潛伏期明顯延長，錯誤次數(shù)明顯減少，有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；FOPS-b中(30 mg/kg)劑量組反應期縮短，潛伏期延長，錯誤次數(shù)減少有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果提示FOPS-a與FOPS-b組分對AD模型小鼠學習記憶能力有一定的改善作用。

表2 FOPS-a與FOPS-b對跳臺實驗結果的影響

注：與正常組比較，##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較**P<0.01，*P<0.05。

Note:Compared with normal,##P<0.01,#P<0.05;Compared with model,**P<0.01,*P<0.05.

3.2 曠場實驗檢測結果

由表3可知，與正常組比較，模型組水平運動距離與站立次數(shù)顯著減少(P<0.01)；與模型組小鼠相比，F(xiàn)OPS-a與FOPS-b高(60 mg/kg)、中(30 mg/kg)劑量組水平運動距離和站立次數(shù)明顯增多，有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)，低劑量組(15 mg/kg)有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。表明FOPS-a與FOPS-b能夠提高小鼠的運動及空間探索能力，并具有一定的劑量依賴性。

表3 FOPS-a與FOPS-b對曠場實驗的影響

注：與對照組比較，##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較**P<0.01，*P<0.05。

Note：Compared with normal,##P<0.01,#P<0.05;Compared with model,**P<0.01,*P<0.05.

3.3 尼氏染色實驗結果

尼氏染色結果可見正常組的神經(jīng)元數(shù)目較多，排列緊湊有序，細胞結構形態(tài)正常，結構清晰，胞質中尼氏體豐富、細胞核淡藍色，背景略呈淺藍色，核仁清晰可見。模型組小鼠神經(jīng)元水腫，細胞數(shù)量明顯減少，細胞間隙增大，排列稀疏且分布紊亂、松散，無明顯層次，細胞體積減小萎縮，胞漿內尼氏體減少，分界不清，核固縮，使得著色加深。與模型組相比較，多奈哌齊組、FOPS-a與FOPS-b藥物高、中、低各劑量組的小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)有不同程度的改善，神經(jīng)元水腫減輕，細胞數(shù)量相對增多，排量較為整齊，分界清晰。

圖1 組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元尼氏染色(×20.0)Fig.1 Nissl staining of hippocampus in each group of mice(×20.0)注：A正常組，B模型組，C多奈哌齊組，D阿里紅多糖a組分高劑量組，E阿里紅多糖a組分中劑量組，F(xiàn)阿里紅多糖a組分低劑量組，G阿里紅多糖b組分高劑量組，H阿里紅多糖b組分中劑量組，I阿里紅多糖b組分低劑量組。下同。Note:A is normal,B is model,C is Donepezil,D is FOPS-a-H,E is FOPS-a-M,F is FOPS-a-L,G is FOPS-b-H,H is FOPS-b-M,I is FOPS-b-L,the same below.

3.4 RT-PCR檢測結果

RT-PCR法檢測小鼠海馬區(qū)相關mRNA轉錄水平的結果表明，與對照組比較，模型組GSK3β、Tau mRNA表達均升高(P<0.01)，AKT mRNA表達降低(P<0.01)；與模型組相比，多奈哌齊劑量組、FOPS-a與FOPS-b高(60 mg/kg)劑量組GSK3β、Tau mRNA的表達量均降低(P<0.01，P<0.05)，AKT mRNA表達量升高(P<0.01，P<0.05)； 結果表明FOPS-a與FOPS-b可提高AKT的表達量并抑制GSK3β、Tau mRNA的表達。

表4 FOPS-a與FOPS-b對海馬區(qū)AKT、GSK3β、Tau mRNA表達的影響

注：與對照組比較，##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05。

Note:Compared with normal,##P<0.01,#P<0.05;Compared with model,**P<0.01,*P<0.05.

3.5 Western-blot檢測結果

Western-blot法檢測結果表明，與對照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)GSK3β、Tau、P-tau蛋白的表達量均上調(P<0.01)，AKT蛋白表達顯著下調(P<0.01)；與模型組比較，F(xiàn)OPS-a與FOPS-b高(60 mg/kg)、中(30 mg/kg)劑量組小鼠海馬GSK3β、Tau、P-tau蛋白的表達量均明顯下調(P<0.01)，AKT蛋白表達顯著上調(P<0.01)。提示FOPS-a與FOPS-b能夠提高上游蛋白AKT的表達量，阻礙下游GSK3β、Tau、P-tau蛋白的表達，拮抗AD的發(fā)展。

4 討論

AD是一種以智力緩慢進行性喪失為特征的神經(jīng)退行性疾病，是發(fā)生在中樞神經(jīng)的一種病因復雜的原發(fā)性疾病。主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙和記憶功能減退。由于 AD 的發(fā)病機制較復雜，研究者形成了眾多不同的假說，其中Aβ淀粉樣學說和Tau蛋白學說是目前比較公認的AD發(fā)病機制[19]。而 APP/PS1轉基因小鼠模型是經(jīng)典的 AD 轉基因動物模型之一，能夠較好的模擬AD患者早期病理和行為特征[20]。

本研究觀察了FOPS-a與FOPS-b對 APP/PS1轉基因小鼠學習記憶改善作用。在實驗中，對小鼠認知功能的評估，我們采取了跳臺實驗和曠場實驗。跳臺實驗是一種抑制性被動回避實驗，在記憶研究中，動物模型最重要的特點是抑制模仿活動或學習習慣。被動回避實驗通過動物學會去掉某種特定的行為而逃避某種厭惡的事情。跳臺實驗中，轉基因對照組小鼠第一次穿越原平臺的時間較野生型小鼠明顯延長(P<0.05)，而穿越平臺次數(shù)比野生型小鼠明顯減少(P<0.01)，F(xiàn)OPS-a與FOPS-b高、中(60和30 mg/kg)劑量組與模型組相比，學習與記憶成績有不同程度提高。由于嚙齒類動物具體有趨觸性，指小鼠畏懼開闊、未知、可能存在潛在危險的場所，因而行為表現(xiàn)出“貼墻”活動的特性。曠場測試結果表明，模型組小鼠自主活動以四角和邊緣探索為主，而FOPS-a與FOPS-b高劑量組較模型組相比，表現(xiàn)為多以向中心探索為主。

海馬是研究人類和動物學習記憶功能的重要腦區(qū)，AD患者的主要臨床癥狀是陳述性記憶受損，這與患者海馬神經(jīng)元結構改變密切相關。尼氏體是神經(jīng)元的特征性結構，在正常的生理情況下，尼氏體大而多，在神經(jīng)細胞中合成蛋白的功能較強，在病理情況下，由于神經(jīng)元的損傷，尼氏體數(shù)量減少甚至消失。尼氏染色結果表明，模型組小鼠的神經(jīng)細胞受損嚴重，甚至變形萎縮。FOPS-a與FOPS-b不同劑量組相比于模型組對抑制神經(jīng)元損傷有不同程度的改善作用。

Tau及P-tau蛋白是目前了解AD發(fā)病機制的熱點靶標之一。研究發(fā)現(xiàn)與P-tau的形成最為相關的是參與調節(jié)Tau蛋白異常磷酸化的激酶：糖原合成激酶3β(GSK-3β)。其異常激活會導致 Tau 蛋白過度磷酸化[21,22]。AKT蛋白是參與調控GSK3β的活性的主要蛋白，當AKT蛋白合成障礙時，對GSK3β抑制作用下降，GSK3β失去控制被激活促使Tau蛋白異常磷酸化聚集成螺旋絲最終形成纖維纏結。RT-PCR與Western-blot法檢測AKT、GSK3β、Tau、P-tau蛋白的結果表明：FOPS-a與FOPS-b能明顯下調GSK3β、Tau、P-tau的表達量，上調AKT蛋白表達，通過減少神經(jīng)元的受損，拮抗AD的發(fā)展過程。

圖2 FOPS-a與FOPS-b對海馬區(qū)AKT、GSK3β、Tau、P-tau蛋白表達的影響Fig.2 Effects of FOP component on expression of AKT、GSK3β、Tau、P-tau protein in hippocampus注：與對照組比較，##P<0.01，#P<0.05；與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05；a和e是AKT的蛋白表達，b和f是GSK3β蛋白的表達，c和g是Tau蛋白的表達，d和h是P-tau蛋白的表達。Note:Compared with normal,##P<0.01,#P<0.05;Compared with model,**P<0.01,*P<0.05;a and e are AKT protein expressions,b and f are GSK3β protein expressions,c and g are Tau protein expressions,d and h are P-tau protein expressions.

綜上所述，經(jīng)阿里紅多糖組分(FOPS-a、FOPS-b)干預后，能有效改善APP/PS1轉基因小鼠學習與記憶障礙，降低Tau蛋白的磷酸化，減少神經(jīng)原纖維纏結，其機制可能是與抑制GSK3β信號通路相關蛋白表達有關。