郭磊，孫琪，保瑞景，譚大聰，華燕，闞歡

(1.西南林業(yè)大學(xué) 云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650224)

美味牛肝菌(BoletusedulisBull. Fr.)是一種世界范圍內(nèi)分布的著名的野生菌，兼具食藥用經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1,2]。中國是美味牛肝菌的主要分布區(qū)域, 尤其在云南分布廣泛[3]。美味牛肝菌含有豐富的蛋白質(zhì)、還原糖和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，其中呈鮮味的天門冬氨酸和谷氨酸占總氨基酸含量的25.4%[4,5]。美味牛肝菌還含有多糖、黃酮和多酚等生物活性成分，而多酚是一類具有多個(gè)酚羥基的次生代謝產(chǎn)物，對人體健康有著許多有益的作用，如對阿爾茨海默病、心血管疾病和改善腸道微生物菌群等的保護(hù)作用[6-8]，近年來已成為研究熱點(diǎn)。芒果皮多酚、花椒多酚、甘蔗多酚、生姜多酚、百里香多酚等植物多酚[9-13]的提取及抗氧化研究已有報(bào)道，但關(guān)于美味牛肝菌多酚的研究還鮮有報(bào)道，這不僅限制了美味牛肝菌多酚的生物活性研究，也限制了美味牛肝菌資源特別是功能性調(diào)味料的開發(fā)應(yīng)用。

本研究以美味牛肝菌試驗(yàn)對象，以多酚提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，考察了液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度及提取次數(shù)對多酚提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化美味牛肝菌多酚的最佳提取工藝，為美味牛肝菌多酚資源及功能調(diào)味料的開發(fā)利用提供了一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

美味牛肝菌：購自云南易門縣康源菌業(yè)有限公司；沒食子酸、福林酚、碳酸鈉、無水乙醇：以上均為分析純。

UV-VIS 300紫外分光光度計(jì) 美國賽默飛世爾科技有限公司；BAS2245電子天平 德國賽多利斯集團(tuán)；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 金壇市丹瑞電器廠；3K15低溫離心機(jī) 德國西格瑪公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照侯玉艷的方法略微修改[14]。準(zhǔn)確量取濃度為0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL沒食子酸溶液0.5 mL，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L福林酚試劑搖勻后避光靜置5 min，再加入2.0 mL 7.5% Na2CO3溶液搖勻靜置1 h后在765 nm處測定吸光值，同時(shí)以蒸餾水為空白。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=18.56C+0.015，R2=0.995。

1.2.2 美味牛肝菌多酚的提取

美味牛肝菌子實(shí)體經(jīng)干燥、粉碎、過篩后備用。以多酚提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，研究液料比(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)、提取時(shí)間(min)、提取溫度(℃)及提取次數(shù)對多酚提取率的影響。影響多酚提取率的因素設(shè)以下水平：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時(shí)間 90 min，提取溫度50 ℃，提取2次，考察不同的液料比20，25，30，35，40 (mL/g)對多酚提取率的影響；固定液料比35 (mL/g)，提取時(shí)間90 min，提取溫度50 ℃，提取2次，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(45%、50%、55%、60%、65%)對多酚提取率的影響；固定液料比35(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度50 ℃、提取2次，考察不同提取時(shí)間(30，60，90，120，150 min)對多酚提取率的影響；固定液料比35 (mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間90 min、提取2次，考察不同提取溫度(35，40，45，50，55 ℃)對多酚提取率的影響；固定液料比35(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間90 min，提取溫度45 ℃，考察不同提取次數(shù)(1，2，3次)對多酚提取率的影響。

1.2.3 多酚含量的測定

多酚提取液經(jīng)抽濾后按照1.2.1的方法測定吸光值，計(jì)算出美味牛肝菌多酚的提取率。

提取率(%)=[(C×V×n)/(m×1000)]×100。

(1)

式中：C為美味牛肝菌提取液中多酚的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為美味牛肝菌質(zhì)量，g。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對美味牛肝菌多酚提取率影響較大的因素液料比(A，mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B，%)、提取時(shí)間(C，min)和提取溫度(D，℃)，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，利用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法，試驗(yàn)因素水平設(shè)置見表1。

使用數(shù)據(jù)分析軟件Design Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過F檢驗(yàn)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立及分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behenken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取液料比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)和提取溫度(D)為自變量，美味牛肝菌多酚提取率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

續(xù) 表

采用Design Expert 8.0.6對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸結(jié)果分析見表3，對4個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程：

Y =1.34+0.050A+0.031B-0.013C+0.0065D+0.025AB+0.0045AC-0.014AD+0.016BC+0.0095BD+0.0050CD-0.062A2-0.049B2-0.030C2-0.054D2。

(2)

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

續(xù) 表

注：“*”代表顯著，P<0.05；“**”代表非常顯著，P<0.01。

由表3可知，該模型顯著(P<0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)。通過模型的回歸方差分析結(jié)果可以看出，一次項(xiàng)中液料比(A)對多酚提取率的影響非常顯著(P<0.01)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)對多酚提取率的影響顯著，而提取時(shí)間(C)和提取溫度(D)對多酚提取率的影響不顯著。二次項(xiàng)A2和D2對多酚提取率的影響非常顯著，B2對多酚提取率的影響顯著。交互項(xiàng)對多酚提取率的影響均不顯著。由P值可知，各因素對美味牛肝菌多酚提取率影響的大小順序?yàn)椋阂毫媳?A)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)>提取時(shí)間(C)>提取溫度(D)。

2.2 響應(yīng)面分析

液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度對美味牛肝菌多酚提取率影響的響應(yīng)面圖見圖1。

圖1 兩因素間交互作用對多酚提取率的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots of interaction of two factors on extraction rate of polyphenols from Boletus edulis

圖1分別反映了液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和提取時(shí)間、液料比和提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度、提取時(shí)間和提取溫度對美味牛肝菌多酚提取率的交互影響效應(yīng)。由圖1可知，響應(yīng)面圖都比較陡峭，說明美味牛肝菌多酚的提取率隨其中任意兩個(gè)變量的增加均呈現(xiàn)上升趨勢。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

對回歸方程(1)求解，即美味牛肝菌多酚提取率達(dá)到最大值的工藝條件為：液料比37.44 (mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)57.20%、提取時(shí)間88.06 min、提取溫度45.16 ℃、提取2次，在此條件下多酚的提取率為1.36%。為方便實(shí)際操作將試驗(yàn)條件調(diào)整為液料比37 (mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)57%、提取時(shí)間90 min、提取溫度45 ℃，提取2次、通過驗(yàn)證得出美味牛肝菌多酚的平均提取率為1.33%，與理論值相差0.03%，與模型預(yù)測值相近，說明該回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)過程匹配程度高，可以有效地優(yōu)化美味牛肝菌多酚的提取工藝。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇影響美味牛肝菌多酚提取率的4個(gè)因素(液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度)為自變量，采用四因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化多酚的最佳提取工藝。通過驗(yàn)證試驗(yàn)得出在液料比37(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)57%、提取時(shí)間90 min、提取溫度45 ℃、提取2次的條件下，美味牛肝菌多酚的提取率達(dá)到1.33%±0.02%。研究結(jié)果為美味牛肝菌多酚及功能性調(diào)味料的資源開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。