胡文康，孫莉，王嘉瑞，李青卓，汪超，徐寧

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068)

腐乳又稱豆腐乳，是一種發(fā)源于我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。腐乳是豆腐經(jīng)多種微生物發(fā)酵后，加入黃酒、胡椒、茴香等不同香料后混合制成[1]，其富含氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素等[2-4]，具有降血壓、降血脂、抗氧化的功能[5，6]，是不可多得的餐桌美食。腐乳廣泛地分布于全國各地，由于各地的氣候物產(chǎn)、風(fēng)俗習(xí)慣、飲食愛好存在著較大差異，各地的腐乳也有獨(dú)特的風(fēng)味[7]，通常根據(jù)其不同的風(fēng)味分為青方、紅方、白方三大類。腐乳各自獨(dú)特的風(fēng)味成分是由豆腐胚中植物蛋白質(zhì)、碳水化合物等在不同微生物的作用下分解成風(fēng)味多肽、氨基酸及脂肪酸等風(fēng)味前體物質(zhì)[8]，再經(jīng)過后酵產(chǎn)生的[9]。

目前，國內(nèi)外對腐乳的風(fēng)味研究主要集中在單一類型腐乳方面，劉娜等[10]使用GC-MS和氣相色譜-嗅聞儀(GC-O)對紅方腐乳進(jìn)行風(fēng)味分析；馬艷莉等[11]使用動態(tài)頂空稀釋法(DHDA)與GC-MS聯(lián)用測定了青方腐乳的風(fēng)味物質(zhì)；蔣麗婷等[12]使用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用的方法測定了白方腐乳中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，但是不同種類腐乳之間的區(qū)別還鮮有報(bào)道。

本文以青方、紅方、白方腐乳為研究對象，采用同時(shí)蒸餾萃取和HS-SPME與GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析其揮發(fā)性成分的種類及含量，探索不同類型腐乳風(fēng)味成分的差異及特點(diǎn)，為腐乳間風(fēng)味物質(zhì)的研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腐乳：購于超市；王致和臭豆腐(青方)、王致和大塊腐乳(紅方)、王致和精致白腐乳(白方)：北京二商王致和食品有限公司；氯化鈉、二氯甲烷、無水硫酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent GC-MS 7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；SPME手動進(jìn)樣手柄及萃取頭(CAR/PDMS) 美國Supelco公司；HH-8CJ數(shù)顯磁力攪拌恒溫水浴鍋 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；氮?dú)獯祾邇x 常州朗越儀器制造有限公司。

1.2 腐乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測方法

1.2.1 同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)

1.2.1.1 萃取方法

取30 g腐乳固形物，搗碎，與150 mL 去離子水充分混勻后加入到SDE裝置水相一側(cè)500 mL圓底燒瓶中，在SDE裝置有機(jī)相一側(cè)100 mL圓底燒瓶中加入50 mL二氯甲烷，用電熱套加熱水相燒瓶，使其中溶液保持沸騰；有機(jī)相燒瓶于40 ℃恒溫水浴，整個提取過程持續(xù)2 h，收集萃取液，置于-20 ℃冰箱冷藏24 h后，使用無水硫酸鈉過濾除水。再經(jīng)韋氏分餾柱蒸餾和氮吹濃縮至1 mL，0.22 μm有機(jī)膜過濾后，加入100 μL 0.381 mg/mL 2-辛醇的二氯甲烷溶液作為內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行GC-MS 檢測。

1.2.1.2 GC-MS檢測條件

色譜柱：Agilent HP-5MS(30 cm×250 mm×0.25 μm)；程序升溫：初溫50 ℃，保持1 min， 以3 ℃/min的速率升溫到185 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min的速率升溫到250 ℃，保持8 min；溶劑延遲5 min。

電離方式：EI；電子能量：70 eV；掃描質(zhì)量：35～400 amu。

1.2.2 頂空固相微萃法(HS-SPME)

1.2.2.1 萃取方法

取5.0 g 腐乳固形物，搗碎，與100 μL 0.381 mg/mL 2-辛醇的水溶液、1 g 氯化鈉、5 mL 去離子水混合于頂空瓶中，然后于60 ℃磁力攪拌水浴鍋中30 min，萃取30 min，進(jìn)樣。

1.2.2.2 GC-MS檢測條件

色譜柱：Agilent HP-5MS(30 cm×250 mm×0.25 μm)；程序升溫：初溫50 ℃，保持1 min，以15 ℃/min的速率升溫到185 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min的速率升溫到250 ℃，保持1min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，解吸3 min。

電離方式：EI；電子能量：70 eV；掃描質(zhì)量：35～400 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Agilent GC-MS處理軟件處理原始數(shù)據(jù)，使用NIST 14數(shù)據(jù)庫檢索定性，使用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各物質(zhì)含量，通過Simca-P軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳中共有揮發(fā)性物質(zhì)

表1 SDE法檢測的揮發(fā)性成分及其組分含量Table 1 The volatile components and their content detected by SDE method

續(xù) 表

續(xù) 表

由表1可知，3種腐乳通過SDE-GC-MS法測定出揮發(fā)性物質(zhì)共114種，紅方腐乳檢出物質(zhì)53種，其中酯類物質(zhì)19種，雜環(huán)類物質(zhì)5種，烯類物質(zhì)3種，酮類物質(zhì)2種，烴類物質(zhì)2種，酸類物質(zhì)6種，醛類物質(zhì)6種，酚類物質(zhì)3種，醇類物質(zhì)4種，其他類3種，未檢出芳香類物質(zhì)；白方腐乳檢出物質(zhì)50種，其中酯類物質(zhì)16種，雜環(huán)類物質(zhì)3種，烯類物質(zhì)6種，酮類物質(zhì)2種，烴類物質(zhì)1種，酸類物質(zhì)3種，醛類物質(zhì)4種，酚類物質(zhì)3種，醚類物質(zhì)1種，芳香類物質(zhì)1種，醇類物質(zhì)5種，其他類2種；青方腐乳檢出物質(zhì)44種，其中酯類物質(zhì)13種，雜環(huán)物質(zhì)2種，烯類物質(zhì)1種，酮類物質(zhì)1種，烴類物質(zhì)6種，酸類物質(zhì)7種，醛類物質(zhì)1種，醚類物質(zhì)2種，酚類物質(zhì)2種，芳香類物質(zhì)1種，醇類物質(zhì)4種，其他種類4種。

圖1 SDE法提取不同種類腐乳物質(zhì)的含量Fig.1 The content of volatile components from different kinds of sufu extracted by SDE

由圖1可知，3種腐乳中酯類物質(zhì)含量均很高，白方腐乳中的醇類物質(zhì)含量最高，青方中酚類物質(zhì)含量最高，并且含有其他兩種腐乳中沒有的含硫類化合物和胺類化合物。

表2 HS-SPME法檢測的揮發(fā)性成分及其組分含量Table 2 The volatile components and their content detected by HS-SPME method

續(xù) 表

續(xù) 表

由表2可知，通過HS-SPME-GC-MS法測定，一共檢出揮發(fā)性物質(zhì)102種，紅方腐乳檢出物質(zhì)52種，其中酯類物質(zhì)17種，酮類物質(zhì)3種，醛類物質(zhì)3種，酚類物質(zhì)6種，醇類物質(zhì)4種，其他類18種；白方腐乳檢出物質(zhì)45種，其中酯類物質(zhì)10種，酮類物質(zhì)1種，醛類物質(zhì)3種，酚類物質(zhì)6種，醇類物質(zhì)5種，其他類20種；青方腐乳檢出物質(zhì)40種，其中酯類物質(zhì)10種，酮類物質(zhì)1種，醛類物質(zhì)1種，酚類物質(zhì)6種，醇類物質(zhì)6種，其他類16種。

圖2 HS-SPME法提取不同種類腐乳物質(zhì)的含量Fig.2 The content of volatile components from different kinds of sufu extracted by HS-SPME

由圖2可知，紅方腐乳與青方腐乳的酯類物質(zhì)含量較高，白方腐乳的醇類物質(zhì)含量最高，青方腐乳的酚類和雜環(huán)類物質(zhì)含量最高。

根據(jù)3種腐乳所鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)繪制韋恩圖(見圖3)，發(fā)現(xiàn)不同腐乳之間區(qū)別較大，在3種腐乳中均被鑒定出的物質(zhì)僅有14種，分別是苯酚、對乙基苯酚、苯乙醇、桉葉油醇、二叔十二烷基二硫化物、植烷、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、硬脂酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕櫚酸、苯乙醇、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸。

圖3 不同種類腐乳中物質(zhì)韋恩圖Fig.3 The Venn plot of substances from different kinds of sufu

在腐乳中，烴類物質(zhì)的產(chǎn)生可能是由于脂肪的分解。但烴類物質(zhì)風(fēng)味閾值較高，香氣特征并不明顯，故對各類腐乳風(fēng)味的貢獻(xiàn)不大[13]。烯類物質(zhì)檢出12種，但并沒有檢測出3種腐乳共有的物質(zhì)。酯類物質(zhì)是在腐乳前期發(fā)酵過程中，醇和脂肪酸通過酯化反應(yīng)所生成的，能夠賦予腐乳花香、果香或者蜂蜜味[14]。在3種腐乳中的共同檢測出的酯類物質(zhì)主要有亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、硬脂酸乙酯以及2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯等。酯類物質(zhì)氣味濃郁，香氣持久，兩種方法所檢出的酯類化合物相對占比均較多，共同構(gòu)成腐乳香氣的主體部分。在3種腐乳中共檢測出16種醇類化合物，如乙醇、苯乙醇、4-萜烯醇、柏木腦、桉葉油醇、苯甲醇、芳樟醇等。在發(fā)酵過程中，雜菌的影響會使腐乳產(chǎn)生不良?xì)馕?，而醇類物質(zhì)能夠?qū)⑵溲谏w；苯甲醇能夠產(chǎn)生櫻桃味道，其他幾種醇類物質(zhì)賦予腐乳堅(jiān)果味、果香等[15]。醛類化合物通過Strecker反應(yīng)和腐乳中亞油酸等物質(zhì)氧化反應(yīng)產(chǎn)生，該類香氣濃烈，可能對腐乳的風(fēng)味產(chǎn)生重要作用[16]。在3種腐乳中共檢測出12種醛類物質(zhì)，其中苯甲醛具有櫻桃或杏仁氣味，苯乙醛具有面包香和玫瑰氣味，其他醛類物質(zhì)賦予腐乳甜味、水果味等芳香特質(zhì)。酮類化合物是在霉菌酶系的作用下氧化或降解脂質(zhì)的產(chǎn)物。這類物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定、有著良好的氣味。在3種腐乳中共檢測出8種酮類化合物，其中甲基環(huán)戊烯醇酮能夠賦予腐乳甘草氣味。吡嗪類物質(zhì)具有堅(jiān)果香。呋喃類物質(zhì)具有焦香。

2.2 腐乳中特有風(fēng)味物質(zhì)

2.2.1 青方腐乳中特有的風(fēng)味物質(zhì)

青方腐乳中含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)有吲哚、苯酚、丁酸丁酯、亞油酸乙酯、丁酸丙酯、2,4-二叔丁基苯酚、油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯乙醇、桉葉油醇等。

青方腐乳是3種腐乳中風(fēng)味最為獨(dú)特的一種，其“聞著臭吃著香”的特點(diǎn)使其收獲了大批喜好者。根據(jù)氣質(zhì)定性結(jié)果來看，青方腐乳含有高濃度吲哚和含硫類化合物，這與馬艷莉等的研究報(bào)道一致。吲哚在極低濃度時(shí)具有茉莉花香，而當(dāng)濃度上升后，則會呈現(xiàn)出接近于人類排泄物的味道，此外，青方腐乳檢出了二甲基三硫、二叔十二烷基二硫化物等多種含硫類化合物，這些化合物產(chǎn)生臭雞蛋的氣味，這些可能是青方腐乳具有獨(dú)特風(fēng)味的主要原因。青方腐乳含有多種酸類物質(zhì)，如丁酸、辛酸等，少量的丁酸具有水果香氣，而過量的丁酸則被報(bào)道具有“汗?fàn)睢⑺嵛?、刺激性氣味”[17]，這可能也是構(gòu)成青方腐乳獨(dú)特風(fēng)味的原因之一。

青方腐乳樣品中的酯類物質(zhì)總含量與其他兩種腐乳相比相差不大，特有的丙酸丁酯具有獨(dú)特的蘋果香氣，這在馬艷莉等[18]的報(bào)道中也有提及，但是由于過多的臭味物質(zhì)的存在，這些味道被掩蓋，難以被察覺。此外，青方腐乳含有著高濃度的酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠賦予腐乳木香、藥香、辛香、丁香等香氣特征[19]。但是是否較高濃度的酚類物質(zhì)也會產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味參與青方氣味的構(gòu)成，尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

2.2.2 白方腐乳中風(fēng)味物質(zhì)

白方腐乳中含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)有茴香腦、辛酸乙酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、苯乙醇、亞油酸、丁酸丁酯、間二甲苯、二甲基三硫、苯酚等。

白方腐乳具有含量較高的酯類與醇類物質(zhì)。酯類化合物是構(gòu)成腐乳風(fēng)味最基本也是最主要的物質(zhì)，由于不含有刺激性極大的風(fēng)味物質(zhì)(如青方腐乳中的吲哚)或制作過程中人工添加其他調(diào)味料(如紅方腐乳中的紅曲等)，白方腐乳能夠最大程度地展現(xiàn)豆腐發(fā)酵后的真實(shí)風(fēng)味，所以白方腐乳樣品中所檢測出的酯類物質(zhì)在其他2種腐乳中均有檢出，卻能夠更加明顯地呈現(xiàn)出由酯類物質(zhì)所賦予的風(fēng)味特征。

白方腐乳樣品中檢測出了以下醇類物質(zhì)：茴香腦，含量較高，具有茴香味和甜味；芳樟醇，具有百合花香氣[20]；松油醇，具有紫丁香的香氣。這些醇類物質(zhì)賦予了白方腐乳溫和、純正的香氣，這與Liu等的研究報(bào)道一致[21]。在白方腐乳中，同樣也檢測出了含硫類化合物的存在，但是并沒有明顯的令人不適的味道出現(xiàn)，這可能是由于醇類物質(zhì)含量較多，能夠?qū)⒉涣細(xì)馕堆谏w。

此外，在白方腐乳中檢測出了兩種烯類物質(zhì)，石竹烯具有辛香、木香、柑橘香、樟腦香、溫和的丁香香氣；檸檬烯具有檸檬香氣[22]。

2.2.3 紅方腐乳中特有風(fēng)味物質(zhì)

發(fā)酵腐乳過程中加入紅曲和其他香料，便可制得紅方腐乳，顏色鮮亮，氣味較青方腐乳更加令人接受。紅方腐乳樣品中所檢測出的醇類物質(zhì)是3種腐乳中含量最少的，與以往報(bào)道有所出入。這可能是由于本次實(shí)驗(yàn)均為提取腐乳固形物，而紅方腐乳人工添加的香料多存在腐乳汁中，故本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)這種狀況。

紅方腐乳中含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)有硬脂酸乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、3'-甲氧基苯乙酮、丁香酚、十四酸乙酯、十五酸乙酯、辛酸乙酯、乙醇、棕櫚酸乙酯、2,4,6-三羥基苯甲醛、α-石竹烯等。

紅方腐乳樣品中酯類物質(zhì)種類較多，只在紅方腐乳中檢測出的酯類物質(zhì)有苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、3-羥基丁酸乙酯、丁二酸二乙酯、煙酸乙酯等，其中苯乙酸乙酯具有蜂蜜味香氣，乙酸苯乙酯具有甜蜜香氣，壬酸乙酯具有水果、白蘭地香氣，3-羥基丁酸乙酯具有葡萄香和白酒似香氣，這些酯類物質(zhì)的閾值較低，對紅腐乳的香氣貢獻(xiàn)較大[23]。

紅方腐乳樣品中酮類與醛類物質(zhì)含量是三種樣品中最高的。酮類物質(zhì)能夠賦予紅方腐乳甜香，其中2-壬酮還能賦予紅方腐乳水果藥草香氣；醛類物質(zhì)閾值低，呈香能力強(qiáng)，3-甲硫基丙醛具有典型的醬香、咸香，壬醛具有橙香，2-苯基巴豆醛則呈可可和紅茶似香氣。紅方腐乳中還含有的β-石竹烯，具有丁香味。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)研究腐乳特征香氣物質(zhì)

將多次實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換格式后通過Simca-P進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。基于3組腐乳GC-MS結(jié)果所繪制的PCA圖見圖4，其中white組代表白方腐乳樣本，cyan組代表青方腐乳樣本，red組代表紅方腐乳樣本。該模型R2X=0.905，擬合能力強(qiáng)；Q2=0.611>0.5，預(yù)測能力強(qiáng)，該模型可靠。圖中每個點(diǎn)代表了組中的一個單獨(dú)樣本，非監(jiān)督的PCA得分圖反映了樣本的集中趨勢，可以看出3組樣本已經(jīng)有明顯的分離趨勢，說明3組樣本之間存在著顯著差異，同時(shí)樣本內(nèi)部的一致性較好。

圖4 3種腐乳PCA分析圖Fig.4 PCA plot of three kinds of sufu

在此基礎(chǔ)上將3組樣品兩兩進(jìn)行OPLS-DA分析，見圖5。

圖5 3種腐乳OPLS-DA分析圖Fig.5 OPLS-DA plots of three kinds of sufu

OPLS-DA分析可以根據(jù)樣本數(shù)據(jù)，將不同物質(zhì)按照其構(gòu)成組間差異的能力進(jìn)行評估，即VIP值，VIP值越大，說明該物質(zhì)越能使兩組樣本產(chǎn)生差異。選擇VIP值大于1的物質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上從中選出P值小于0.01的物質(zhì)，最后篩選出白方腐乳與青方腐乳之間特征差異物質(zhì)有5個，白方腐乳與紅方腐乳之間有21個，青方腐乳與紅方腐乳之間有3個。利用NIST14數(shù)據(jù)庫對上述物質(zhì)進(jìn)行定性，結(jié)果顯示；在檢測腐乳風(fēng)味的過程中，青方腐乳相較紅方腐乳，紅方腐乳中的辛酸乙酯與青方中的吲哚兩種物質(zhì)對樣本差異的影響最大；白方腐乳與紅方腐乳相比，紅方腐乳中的苯乙醇、正十二烷，白方腐乳的中茴香腦、2,4-二叔丁基苯酚，使得二者有著明顯差異；青方腐乳與白方腐乳相比，青方中的丙酸丁酯、吲哚最能體現(xiàn)其差異。通過統(tǒng)計(jì)分析得出白方腐乳中的茴香腦、青方腐乳中的吲哚是它們各自的特征風(fēng)味物質(zhì)。由于不同物質(zhì)的呈味閾值并不相同，所以還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

3 結(jié)論

本研究采用SDE法和HS-SPME法與GC-MS聯(lián)用分析3種腐乳的揮發(fā)性風(fēng)味成分，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法尋找差異物質(zhì)。結(jié)果表明，3種腐乳因?yàn)榘l(fā)酵菌種、生產(chǎn)工藝的不同，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有著較大差異，苯酚、對乙基苯酚、苯乙醇、桉葉油醇、二叔十二烷基二硫化物、植烷、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯、硬脂酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕櫚酸、苯乙醇、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸等物質(zhì)均存在于3種腐乳中，對腐乳的風(fēng)味有著一定的貢獻(xiàn)。紅方腐乳的酯類物質(zhì)種類最多，酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)的含量最高，在其中檢測出了苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯、3-甲硫基丙醛、壬醛、2-苯基巴豆醛等特有的物質(zhì)。青方腐乳樣品中含有含量最高的酚類物質(zhì)和含硫類物質(zhì)，吲哚的存在使得青方腐乳明顯區(qū)分于另外兩種腐乳。白方腐乳的醇類物質(zhì)含量最高，其中茴香腦、芳樟醇、松油醇、石竹烯、檸檬烯等是只在白方腐乳中檢測出的物質(zhì)，而且茴香腦是白方腐乳中的特征物質(zhì)。腐乳之間不同的揮發(fā)性風(fēng)味成分區(qū)別較大，為進(jìn)一步確定不同腐乳風(fēng)味成分的研究提供了基礎(chǔ)。