王 華,李 娟

(1.蘭州市第二人民醫(yī)院,蘭州 甘肅 730000; 2.蘭州市第一人民醫(yī)院,蘭州 甘肅 730000)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO,world health organization) 的調(diào)查,胃癌目前是全球每年腫瘤相關(guān)死亡的第4大原因,在2018年,全球有約1 033 701新發(fā)病例,其中死亡約782 685例[1]。根治性手術(shù)仍然是目前唯一可能治愈的治療方式,然而胃癌根治術(shù)后5年生存率為20%～30%[2],這主要與胃癌發(fā)病隱匿,在形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分高級別上皮內(nèi)瘤變與早期胃癌有關(guān),使得早期診斷存在困難[3]。自噬是一種與凋亡相似的生物現(xiàn)象,是存在于真核細胞中的一種進化保守的分解代謝過程,在調(diào)節(jié)細胞的生存和凋亡,維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面起著重要作用[4-5]。越來越多的研究表明,自噬在腫瘤的演進過程中扮演著重要的角色[6-7],自噬發(fā)生過程中會出現(xiàn)多種相關(guān)分子的變化,識別這些自噬因子將有利于檢測自噬的發(fā)生。研究采用免疫組化法檢測胃癌細胞中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Beclin1(the beclin1 gene)、絲氨酸-蘇氨酸激酶(ULK)、p62蛋白的表達,并探究其表達與胃癌的相關(guān)性,同時引入自噬抑制劑雷帕霉素及氯喹,進一步研究自噬在胃癌發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

研究收集2019年4月—2019年11月蘭州市第二人民醫(yī)院胃癌組織標本200例,并配對癌旁組織、正常胃組織各200例。所有患者均行胃癌根治術(shù),術(shù)前均未接受任何放療、化療或其他治療,所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實。所有研究對象均簽署知情同意書,并經(jīng)過蘭州市第二人民醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 免疫組織化學(xué)實驗方法

實驗標本經(jīng)中性的福爾馬林固定,進行常規(guī)石蠟包埋,每份標本以4 μm厚度連續(xù)切片5份,1份為HE染色以核實診斷,另外4份分別做mTOR、Beclin1、ULK、p62蛋白的免疫組織化學(xué)染色,全部病理標本均經(jīng)病理檢查確診,染色MaxVision 2/HPR試劑盒按說明書進行,用正置熒光顯微鏡進行觀察。結(jié)果的判定在雙盲下進行,mTOR、Beclin1、ULK、p62表達以細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)明顯的棕黃色為陽性細胞。

1.3 蛋白免疫印跡實驗方法

收集新鮮組織,用PBS洗滌1遍,加RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),混勻,充分震碎離心后,按照BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白,用TBST洗滌3次,每次10 min。將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,然后取出PVDF膜,放入TBST溶解的5%脫脂奶粉中室溫2 h進行封閉。封閉后的膜用TBST洗滌1次,共計10 min,接著4 ℃孵育TBST稀釋的抗體mTOR、Beclin1、ULK、p62和內(nèi)參β-ACTIN過夜,回收一抗,用TBST洗膜3次,每次10 min,孵育二抗(1∶5 000),搖床上常溫孵育2 h。使用ECL超敏發(fā)光液進行曝光檢測,最后采用ImageJ軟件對條帶進行灰度分析,計算出目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比。

1.4 MTT、Transwell實驗

以胃癌細胞株為研究模型,采用自噬抑制劑雷帕霉素和氯喹處理細胞后使用MTT實驗檢測胃癌細胞的活力,使用Transwell實驗檢測胃癌細胞的侵襲遷移能力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間比較采用χ2檢驗然后進行t檢驗分析。統(tǒng)計mTOR、Beclin1、ULK、p62的表達與胃癌患者的診斷、發(fā)生發(fā)展、臨床病理特征以及預(yù)后之間的關(guān)系;使用Kaplan-Meier法計算生存率,分析mTOR、Beclin1、ULK、p62的表達與胃癌患者生存率的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組免疫組化結(jié)果及細胞個數(shù)

研究采用不同濃度自噬抑制劑雷帕霉素處理細胞后,免疫組化結(jié)果如圖1所示。0 nmol/L組細胞個數(shù)為400個,0.1 nmol/L組細胞個數(shù)為318個,1 nmol/L組細胞個數(shù)為253個,10 nmol/L組細胞個數(shù)為194個,100 nmol/L組細胞個數(shù)為126個,如圖2所示。

圖1 采用不同濃度自噬抑制劑雷帕霉素處理細胞后各組免疫組化結(jié)果Fig.1 Results of each group by means of immunohistochemistry after processing cells with different concentrations of autophagy inhibitor rapamycin

圖2 采用不同濃度自噬抑制劑雷帕霉素處理細胞后各組細胞個數(shù)Fig.2 Number of cells in each group after processing cells with different concentrations of autophagy inhibitor rapamycin

實驗采用不同濃度自噬抑制劑氯喹處理細胞后,免疫組化結(jié)果如圖3所示。0 μmol/L組細胞個數(shù)為369個,5 μmol/L組細胞個數(shù)為282個,10 μmol/L組細胞個數(shù)為214個,15 μmol/L組細胞個數(shù)為103個,20 μmol/L組細胞個數(shù)為65個,如圖4所示。

2.2 正常、癌旁、腫瘤細胞中各蛋白表達量

胃癌細胞組與癌旁細胞組相比,mTOR蛋白表達率顯著降低(p<0.05),Beclin1、ULK、p62各蛋白表達率顯著升高(p<0.05),如表1和圖5所示。

2.3 胃癌細胞增值抑制率的變化

采用不同濃度自噬抑制劑雷帕霉素處理細胞后,0 nmol/L組、0.1 nmol/L組、1 nmol/L組、10 nmol/L組、100 nmol/L組之間細胞增值抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(n=6,F=136.864,P<0.05),如圖6所示。

圖3 采用不同濃度自噬抑制劑氯喹處理細胞后各組免疫組化結(jié)果Fig.3 Results of each group by means of immunohistochemistry after processing cellswith different concentrations of autophagy inhibitor chloroquine

圖4 采用不同濃度自噬抑制劑氯喹處理細胞后各組細胞個數(shù)Fig.4 Number of cells in each group after processing cells withdifferent concentrations of autophagy inhibitor chloroquine

采用不同濃度自噬抑制劑氯喹處理細胞后,0 μmol/L組、5 μmol/L組、10 μmol/L組、15 μmol/L組、20 μmol/L組之間細胞增值抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(n=6,F=1 086.891,P<0.05),如圖7所示。

3 討論

研究結(jié)果顯示,與癌旁組織及正常組織相比,在胃癌組織中mTOR表達明顯降低,ULK、Beclin1、p62的表達顯著增高。自噬抑制劑雷帕霉素及氯喹能夠顯著抑制胃癌細胞的增殖,其作用隨著藥物濃度的增加而增加。

表1 正常細胞組織、癌旁細胞組織和腫瘤細胞組織中mTOR、Beclin1、ULK、p62各蛋白表達率

圖6 采用不同濃度自噬抑制劑雷帕霉素處理細胞48 h后,各組細胞增值抑制率變化Fig.6 Changes in cell proliferation inhibition rate of cells in each group after processing with different concentrations of autophagy inhibitor rapamycin after 48 hours

自噬相關(guān)基因(ATG,autophagy-related genes)是一類進化保守的基因家族,參與自噬調(diào)控。Beclin1為ATG6的同系物,被認為是一種是潛在的抑癌基因[8],主要分布在細胞漿內(nèi),通過與PI3K 第Ⅲ類激酶 (也稱為 Vps34)結(jié)合形成Ⅲ型磷脂酰肌醇-3磷酸激(PI3K)復(fù)合體參與自噬的起始過程并促進自噬體的形成,是自噬第一階段不可或缺的基因[9]。Beclin1 可激活自噬過程,是維持細胞自噬活性的關(guān)鍵,而其表達缺失可顯著增加肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生率,多項研究表明,胃癌組織中Beclin1表達顯著升高,提示胃癌組織中自噬體活性增高,細胞自噬水平上調(diào)。這與研究中胃癌細胞的Beclin1高表達,細胞自噬水平上調(diào)有利于胃癌進展的結(jié)果一致。相似的研究顯示,Beclin1在胃癌組織中的表達水平高于非腫瘤胃黏膜組織,表達水平與腫瘤分級有關(guān),并認為Beclin1是胃癌患者的獨立預(yù)后因素[10]。

圖7 采用不同濃度自噬抑制劑氯喹處理細胞24 h后各組細胞增值抑制率變化Fig.7 Changes in cell proliferation inhibition rate of cells in each group after processing with different concentrations of autophagy inhibitor chloroquine after 24 hours

ULK屬于ATG1的同系物,是一種多分子復(fù)合物的組成部分,可促進磷酸化并誘導(dǎo)自噬,其與mTOR相互作用從而調(diào)節(jié)自噬體的形成及其與溶酶體的延伸、融合等過程。細胞自噬過程的激活和抑制受多種細胞信號通路的調(diào)控,其中 PI3K/AKT/mTOR 信號通路已被證實是調(diào)控自噬的主要信號通路,該通路中的mTOR是調(diào)控自噬的重要分子。mTOR 的激活可以抑制 ULK和自噬的相互作用,抑制mTOR 的活性即可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。Zhao等[11]認為在上皮內(nèi)瘤變階段,mTOR被激活,細胞開始處于活躍增殖狀態(tài)。伴隨腫瘤進展,為適應(yīng)腫瘤細胞快速生長和代謝需求,mTOR 水平逐漸降低,腫瘤細胞自噬活性增強,以維持腫瘤細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。這與我們研究中胃癌細胞的mTOR低表達,ULK高表達及激活自噬有利于胃癌進展的結(jié)果一致。

p62是選擇性自噬的底物,是一種泛素結(jié)合蛋白,有研究表明,p62表達上調(diào)和(或)低效降解與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12]。自噬缺陷會引起p62 持續(xù)表達,其高表達可以改變核因子KB(NF-KB)的調(diào)控和基因表達,從而表現(xiàn)出促癌作用[10]。結(jié)合研究結(jié)果,胃癌組織中檢測到p62表達水平升高,而在癌旁及正常胃組織中的表達均較弱。p62可能通過提高上調(diào)細胞自噬水平,幫助腫瘤細胞在惡劣條件下存活并增殖,進而促進胃癌的病情進展。

雷帕霉素及氯喹均為自噬特異性抑制劑,雷帕霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類化合物,是 mTOR信號通路抑制劑,氯喹具有弱化溶酶體內(nèi)酸性環(huán)境,穩(wěn)定溶酶體膜的功能。實驗通過觀察在一定時間內(nèi)不同濃度的雷帕霉素及氯喹分別作用于胃癌細胞后癌細胞抑制率的改變,發(fā)現(xiàn)其均可顯著抑制胃癌細胞的生長,且具有明顯的濃度依賴性。這與文獻[13]中的研究結(jié)果相似,文獻[13]中通過流式細胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素可將胃癌細胞周期阻滯在G0/G1期,并且使S期細胞比例降低,從而抑制腫瘤細胞的增殖。文獻[14]中的研究提示氯喹抑制自噬活性后,可能通過激活p53蛋白以及滅活Bcl-2蛋白來誘導(dǎo)胃癌細胞啟動程序性的死亡,引起 Caspase蛋白依賴的細胞凋亡,從而抑制腫瘤細胞的增殖。因此,結(jié)合我們的研究結(jié)果,認為細胞自噬可促進胃癌的發(fā)生,主要原因可能在于:在胃癌的發(fā)展過程中,癌細胞通過增強自噬活性,清除細胞中被損傷的蛋白和細胞器,為其提供滿足自身生長及增殖所需的能量,維持存活及增殖。

綜上所述,自噬相關(guān)蛋白mTOR、Beclin1、ULK、p62均參與了胃癌的發(fā)生,mTOR低表達及ULK、Beclin1、p62高表達可能與促進胃癌發(fā)生有密切關(guān)系,并提示自噬活性的增強可能促進了胃癌的發(fā)生及發(fā)展。