張海璐，黃 翔，楊 燃，安鳳平，艾明艷，黃 群,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

蛋白質(zhì)氧化是目前食品化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，發(fā)生蛋白質(zhì)氧化是肉制品加工過程中影響質(zhì)量的重要因素，不僅會產(chǎn)生有害物質(zhì)、降低肉制品的營養(yǎng)價值，還會改變?nèi)獾募庸みm應(yīng)性[1-2]。蛋白質(zhì)氧化主要是側(cè)鏈氨基酸發(fā)生修飾，包括巰基氧化、芳香族羥基化和羰基形成[3]。自由基氧化導(dǎo)致肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)和聚集，巰基氧化形成二硫鍵是肌原纖維蛋白交聯(lián)方式的一種[4]。Zhou Feibai等[5]報道高水平氧化會誘導(dǎo)肌球蛋白聚集，結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致肌原纖維蛋白凝膠化的改變，但低水平氧化沒有顯著變化。羥自由基氧化減弱凝膠的強(qiáng)度和持水能力，導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化[6]。隨著氧化程度的加深，羰基含量上升、肌肉微觀結(jié)構(gòu)被破壞，肌原纖維出現(xiàn)小片化，蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊的部分結(jié)構(gòu)遭到破壞，使其凝膠結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[7]。已有研究表明，氧化會對豬肉、魚肉凝膠特性產(chǎn)生相關(guān)影響，導(dǎo)致持水性降低，凝膠強(qiáng)度下降等[1,3]。

羊肉肉質(zhì)細(xì)嫩，蛋白質(zhì)含量豐富，膽固醇含量較豬肉和牛肉少，富含豐富的微量元素，是一種受消費(fèi)者喜愛的優(yōu)質(zhì)畜肉[8]。我國羊肉生產(chǎn)量、消費(fèi)量較大，相關(guān)研究較多集中于保鮮技術(shù)、貯藏方式及發(fā)酵香腸等[9-12]。羊肉脂肪含量較高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性較差，易受加工、環(huán)境條件影響而發(fā)生氧化，目前關(guān)于氧化對羊肉蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性的影響鮮見報道。本研究應(yīng)用羥自由基氧化體系，對羊后腿肉進(jìn)行加速氧化，通過探究氧化時間對蛋白羰基和總巰基含量、凝膠特性和流變性質(zhì)的影響規(guī)律，以期為羊肉的保鮮貯存與加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊后腿肉（8 月齡白山羊） 福州山野農(nóng)貿(mào)市場；復(fù)合磷酸鹽、大豆分離蛋白 廣州嘉業(yè)食品配料有限公司；三氯化鐵、抗壞血酸、過氧化氫、乙二胺四乙酸、尿素、鹽酸胍、甘氨酸、三氯乙酸（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動絞肉機(jī) 廣州旭重食品機(jī)械有限公司；UV-1780紫外分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems有限公司；TGL-16冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MCR 301流變儀 奧地利安東帕（中國）有限公司；ADCI全自動色差儀 北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

新鮮羊后腿肉于0～4 ℃預(yù)冷1 h，剔除多余脂肪和結(jié)締組織，將羊肉分割成均勻的肉塊（1 cm×1 cm×1 cm），用流水進(jìn)行清洗，紙巾吸干表面水分后放入4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 羊肉氧化處理

參考Li Shugang等[13]的肉氧化處理方法并適當(dāng)修改。將預(yù)處理后的肉樣均分為4 份，紙巾吸干肉塊表面水分，置于Fenton氧化體系（1.0 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L抗壞血酸和10 mmol/L H2O2）中，肉樣與氧化液比例為2∶1（g/mL）。密封避光于25 ℃恒溫水浴中分別氧化1、3、5 h，獲得不同氧化時間的氧化肉樣；添加1.0 mmol/L乙二胺四乙酸溶液螯合氧化體系中Fe2＋，以終止反應(yīng)。所得肉樣置于4 ℃冰箱中2 h后備用。

1.3.3 肌原纖維蛋白提取

參照孫金輝等[14]的方法并稍作修改。稱取適量經(jīng)過氧化打漿后的羊肉糜，添加肉糜質(zhì)量4 倍體積的0.05 mol/L Na2HPO4溶液（pH 7.0）緩沖溶液，高速勻漿1 min后，3 000×g冷凍離心15 min，取殘?jiān)僦貜?fù)提取2 次。將殘?jiān)c4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液混合，高速勻漿30 s后冷凍離心；所得殘?jiān)貜?fù)上述處理2 次，將所獲殘?jiān)c4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液混合，用蒸煮過的4 層紗布過濾；調(diào)整pH值為6.2后冷凍離心，所得蛋白膏于4 ℃冷藏，1 周內(nèi)用完。

1.3.4 羰基含量測定

參照李德海等[15]的方法并稍作修改。將肌原纖維蛋白用0.4 mol/L NaCl磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）溶解，用2,4-二硝基苯肼反應(yīng)測羰基值。

1.3.5 總巰基含量測定

參照Wang Yu等[16]的方法并稍作修改。用磷酸鹽緩沖液溶解肌原纖維蛋白，用5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)測定吸光度，用13 600 L/（mol·cm）的摩爾消光系數(shù)計算總巰基含量。

1.3.6 羊肉糜的制備

處理后羊肉添加2.5%食鹽、0.3%復(fù)合磷酸鹽和2%大豆分離蛋白（以肉質(zhì)量計），腌制12 h。將腌制好的羊肉打漿3 次（每次30 s）后，加入2%淀粉和20%冰水，繼續(xù)打漿5 min。打漿后肉糜的一部分密封并于4 ℃冷藏，及時測定流變特性。使用灌腸器將另一部分肉糜灌入直徑為22 mm的膠原蛋白腸衣中，制備好的腸放入高溫蒸煮袋真空包裝；75 ℃恒溫水浴蒸煮40 min后，流水冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱過夜，用于肉糜凝膠特性測定。

1.3.7 流變性質(zhì)測定

參照翟小波[17]和Lee[18]等的方法并稍作修改。使用MCR型流變儀測定不同氧化時間處理的羊肉糜的熱動態(tài)流變性。使用不銹鋼圓形平板探頭50 mm進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將肉糜置于2 個平行平板之間，設(shè)定間隔為1 mm，設(shè)定應(yīng)變?yōu)?%。

動態(tài)溫度掃描：用硅油對暴露的肉糜進(jìn)行密封，防止脫水。于20 ℃平衡10 min，以2 ℃/min的速率從20 ℃升溫至75 ℃并保溫10 min；再以恒定速率2 ℃/min從75 ℃降至20 ℃。固定頻率為0.1 Hz，記錄由于肉糜的剛性引起的任何儲能模量（G′）變化。

動態(tài)頻率掃描：0.1～20.0 Hz頻率范圍內(nèi)掃描，記錄在動態(tài)掃描范圍內(nèi)的G′和相位角（tanδ）。

1.3.8 質(zhì)構(gòu)分析和凝膠強(qiáng)度測定

參照王希希等[19]的方法并稍作修改。將制備好的肉糜腸切成表面平整、高1.5 cm的柱狀，室溫回溫2 h。TPA模式分析質(zhì)構(gòu)，探頭型號為P36，觸發(fā)力5 g，5.00 mm/s的速度壓縮50%，測定樣品質(zhì)構(gòu)性質(zhì)。Return To Start模式分析凝膠強(qiáng)度，探頭型號為P0.5，觸發(fā)力10 g，1.00 mm/s的速度壓縮30%，獲取數(shù)據(jù)速度為200 pps，對每種類型至少6 次重復(fù)測試。

1.3.9 持水性測定

持水性用離心法測量。將厚度為5 mm樣品準(zhǔn)確稱質(zhì)量記為m1，后用3 層濾紙包裹，轉(zhuǎn)移到離心管中。4 ℃、5 000×g離心15 min，結(jié)束后對樣品準(zhǔn)確稱質(zhì)量記為m2，持水性計算如式（1）所示。對每種類型至少6 次重復(fù)測試。

1.3.10 色澤測定

用色差儀對5 mm的樣品測定L*（亮度）值，a*（紅度）值和b*（黃度）值，用式（2）計算白度W。對每種類型至少重復(fù)6 次測試。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DPS 7.55軟件分析，用One-way ANOVA進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著，采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白的羰基與總巰基變化

圖 1 羰基和總巰基含量的變化Fig. 1 Changes in carbonyl and total sulfhydryl contents with oxidization time

由圖1可知，隨著氧化時間的延長，羰基含量顯著增加（P＜0.05）。羰基為判定蛋白質(zhì)氧化程度的最主要指標(biāo)，羰基含量的增加可能是蛋白質(zhì)的側(cè)鏈或肽鍵受到—OH的攻擊而引發(fā)[20]，α-氨基己二酸半醛和γ-谷氨酸半醛是形成的羰基化合物，是肉系統(tǒng)中蛋白質(zhì)氧化的生物標(biāo)志物，且在氧化過程中蛋白側(cè)鏈或蛋白空間構(gòu)象也可能發(fā)生改變[21]。此外，隨著氧化時間的延長，總巰基含量顯著下降（P＜0.05）。肌原纖維蛋白的總巰基在加工過程中容易發(fā)生不可逆的氧化狀態(tài)，被氧化成多種氧化產(chǎn)物，使總巰基的含量顯著降低[21]。且多種氧化產(chǎn)物對肌原纖維蛋白凝膠的形成和維持凝膠有一定影響[22]。

2.2 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜流變學(xué)性質(zhì)的影響

2.2.1 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜G′的影響

G′代表隨著材料的彈性組分變化而發(fā)生的變化趨勢，主要反映其凝膠能力[23]。如圖2A所示，隨著頻率的上升，羊肉糜的G′都存在不同程度的上升；在相同振蕩頻率下，隨著氧化時間的延長，G′降低。其可能原因是氧化時間延長導(dǎo)致凝膠中肌原纖維蛋白的初級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子間相互作用和交聯(lián)改變，從而使得肉糜凝膠結(jié)構(gòu)的聚集度降低，G′相應(yīng)降低[24]。相位角為損耗模量（G′′）與G′的比值，說明凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的優(yōu)劣[25]。如圖2B所示，隨著氧化時間的延長，tanδ值增加，表明長時間氧化會破壞肉糜凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖 2 羊肉糜在頻率改變過程中G’（A）和tanδ（B）的變化Fig. 2 Frequency-dependent curves of storage modulus G’ (A) and tanδ (B) for mutton batters with different oxidization times

2.2.2 溫度對蛋白質(zhì)氧化羊肉糜G′的影響

肉糜升溫加熱過程是肉糜受熱變性展開、因凝聚作用而形成凝膠體的過程，屬于不穩(wěn)定的動態(tài)流變進(jìn)程[26]。如圖3A所示，隨著氧化時間的延長，各組G′值的變化趨勢基本趨同；在整個升溫過程中，各實(shí)驗(yàn)組有相似的曲線，肉糜的動態(tài)流變曲線主要呈現(xiàn)出3 個階段的變化。在20～47 ℃期間，G′呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，主要原因可能是從低溫開始升溫的過程中肌原纖維蛋白發(fā)生溶解和溶脹[27]；在48～54 ℃期間G′快速下降，氧化時間越長G′值越低，有可能是溫度的繼續(xù)升高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分變性和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)解離，肌球蛋白尾部發(fā)生解離而使得流動性增加、凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞[18]；在55～75 ℃期間G′隨氧化時間的延長，處于迅速上升的階段，凝膠強(qiáng)度持續(xù)增加，這說明繼續(xù)加熱使得具有黏性的肉糜溶膠轉(zhuǎn)變成彈性凝膠[28]，且氧化5 h樣品的最終G′值低于其他組，表明肉糜在長時間氧化過程中遭受破壞。

降溫過程中體系進(jìn)行重新快速的有序化，體系整體黏彈性增加。如圖3B所示，整個降溫過程中凝膠的G′值呈上升趨勢。氧化5 h蛋白凝膠的G′值低于其他組。隨著溫度的降低，凝膠之間通過氫鍵等相互作用形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，從而G′升高[29]。

圖 3 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜在溫度改變過程中G’的影響Fig. 3 Effect of protein oxidation on G’ of mutton batters during heating and cooling

2.3 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜質(zhì)構(gòu)特性的影響

如表1所示，肉糜的硬度、彈性、凝聚性、膠黏性、咀嚼性、回復(fù)性均隨著氧化時間的延長而下降。硬度和膠黏性在氧化時間3 h后顯著降低，此前變化不顯著。彈性和凝聚性隨著氧化時間的延長而顯著降低，回復(fù)性在氧化3 h時顯著降低。彈性和回復(fù)性的降低說明通過壓縮，肉糜恢復(fù)初始狀態(tài)的能力下降，這與流變性質(zhì)中肉糜的低G′相對應(yīng)；凝聚性降低說明蛋白質(zhì)氧化會導(dǎo)致凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)易于破裂。有研究報道，氧化引起蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生改變和交聯(lián)，影響三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致肉糜凝膠特性劣變[30]；隨著氧化程度的加劇，高濃度的氧化會降低肌原纖維蛋白的硬度和彈性，降低凝膠能力[29]。

表 1 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of protein oxidation on textural properties of mutton batters

2.4 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜凝膠強(qiáng)度的影響

圖 4 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜凝膠強(qiáng)度的影響Fig. 4 Effect of protein oxidation on gel strength of mutton batters

由圖4可知，氧化時間與凝膠強(qiáng)度成負(fù)相關(guān)。與對照組相比，氧化1、3 h的凝膠強(qiáng)度顯著下降（P＜0.05），5 h時趨于平穩(wěn)?？赡苁怯捎谘趸瘯r間的延長，羊肉糜凝膠發(fā)生了部分蛋白與蛋白的交聯(lián)。有研究表明，凝膠強(qiáng)度會隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加而改變，其原因可能與變性造成的蛋白質(zhì)去折疊有關(guān)[3]；還可能是隨著氧化程度的加深，蛋白質(zhì)之間主要支撐凝膠強(qiáng)度的二硫鍵遭到破壞、數(shù)量大幅下降，從而使得凝膠強(qiáng)度降低[31]。

2.5 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜持水性的影響

圖 5 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜持水性的影響Fig. 5 Effect of protein oxidation on water-holding capacity of mutton batters

持水性是肉糜凝膠優(yōu)劣的重要評價指標(biāo)，持水性越高，表明肉糜凝膠保持內(nèi)部游離水分的能力越強(qiáng)。由圖5可知，隨著氧化時間的延長，羊肉糜凝膠的持水性呈下降趨勢。氧化時間在3 h之前，肉糜的持水性顯著降低（P＜0.05）；與氧化3 h樣品相比，5 h樣品的持水性變化不顯著（P＞0.05）?？赡苁且?yàn)榈鞍踪|(zhì)氧化導(dǎo)致疏水基團(tuán)間疏水相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)解聚，降低肌原纖維蛋白凝膠的持水能力，且隨氧化時間的延長，蛋白質(zhì)水合能力逐漸下降[32]；同時蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)與水分子之間的作用力減弱，使得肉糜的持水性下降[33]。Petracci等[34]的研究結(jié)果也表明肌原纖維蛋白分子之間能形成較理想的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但蛋白質(zhì)氧化會破壞其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致凝膠持水性下降。

2.6 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜色澤的影響

表 2 蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜色澤的影響Table 2 Effect of protein oxidation on L*, a* and W values of mutton batters

色澤是影響肉制品食用品質(zhì)、偏好和可接受的重要感官參數(shù)。由表2可知，隨著氧化時間的延長，羊肉糜凝膠的L*值和W值呈顯著下降趨勢（P＜0.05），a*值呈下降趨勢。Nyaisaba等[35]報道了羥自由基氧化處理的鱈魚魚糜凝膠的白度隨著氧化程度增加而顯著下降，與本研究結(jié)果吻合。蛋白凝膠白度能反映蛋白質(zhì)的變性程度，羥自由基氧化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生相互反應(yīng)可能致使蛋白質(zhì)凝膠的白度值下降[36]。水分含量也是影響白度值的因素，氧化時間的延長使肉糜的持水性下降，從而影響肉糜凝膠的色澤[37]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了蛋白質(zhì)氧化對羊肉糜流變性質(zhì)和凝膠特性的影響，結(jié)果表明，隨著氧化時間的延長，羊肉糜肌原纖維蛋白的羰基含量顯著增加、總巰基含量顯著降低，表明蛋白質(zhì)氧化程度逐漸增加。隨著氧化時間的延長，羊肉糜的G′值降低，tanδ值增加，蛋白質(zhì)氧化能破壞肉糜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。升溫過程中G′變化存在3 個階段：20～45 ℃期間為第1階段，G′處于緩慢下降狀態(tài)；46～54 ℃期間為第2階段，G′下降速率加快；55～75 ℃期間為第3階段，G′處于迅速上升狀態(tài)。降溫過程中G′逐漸回升；氧化時間越少，G′終點(diǎn)越高。蛋白質(zhì)氧化降低了羊肉糜的彈性、硬度、凝聚性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)性；蛋白質(zhì)氧化時間延長，羊肉糜凝膠的持水性降低；隨氧化程度加深，肌原纖維蛋白間二硫鍵減少，凝膠強(qiáng)度顯著降低。隨著氧化時間的延長，a*值呈下降趨勢，L*值、W值顯著降低。貯藏、加工中蛋白質(zhì)氧化對羊肉及其制品品質(zhì)的影響機(jī)理有待深入研究，以期為羊肉的貯運(yùn)保鮮和羊肉制品的品質(zhì)提升提供理論基礎(chǔ)。