張 苗，姜 玉，湯 靜，金 鵬，鄭永華*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，江蘇 南京 210095）

西葫蘆（Cucurbita pepo L.）中含有豐富的膳食纖維和維生素，具有較高的營養(yǎng)價值，是一種受廣大消費者喜愛的蔬菜[1]。西葫蘆采后在常溫貯藏過程中極易失水萎蔫和腐爛，從而失去商品性。低溫貯藏是果蔬保鮮的常用方法，但西葫蘆是典型的冷敏性蔬菜，在低溫貯運過程中極易發(fā)生表皮凹陷等冷害癥狀，影響其食用品質(zhì)和經(jīng)濟價值[2]。因此，如何減輕西葫蘆冷害的發(fā)生，保持西葫蘆的品質(zhì)并延長貨架期，是西葫蘆采后冷鏈貯運過程中亟待解決的問題。

冷激（cold shock，CS）作為一種物理處理方式，通過低溫冷空氣或冷水對采后果蔬進行不致發(fā)生冷害和凍害的短時低溫處理來達到保鮮、延長貨架期目的，因為其具有無毒、無污染、無殘留、保鮮效果顯著等特點，而廣泛應用于保鮮領(lǐng)域中[3]。日本學者Ogata等[4]發(fā)現(xiàn)用0 ℃冰水短時處理杏可以延緩杏果實的后熟進而延長杏的保存時間，并首次將這種處理技術(shù)命名為“冷激處理”。隨后，Inaba等[5]也證實冷激處理可以調(diào)節(jié)綠熟期番茄果實的生理狀態(tài)，延緩冷害的發(fā)生并延長貨架期。近年來的研究發(fā)現(xiàn)冷激處理可以提高甘薯[6]和茄子[7]果實的抗冷性，減輕這些果實冷害的發(fā)生，較好保持其貯藏品質(zhì)。甜菜堿（glycine betaine，GB）是一種季胺類物質(zhì)，它通過調(diào)節(jié)植物細胞的滲透壓來保持細胞膜的結(jié)構(gòu)，有研究發(fā)現(xiàn)GB的積累與植物的抗冷性有關(guān)[8]。姚文思等[9]發(fā)現(xiàn)10 mmol/L GB處理可通過調(diào)節(jié)活性氧代謝來降低西葫蘆在冷藏期間冷害的發(fā)生。單體敏等[10]也發(fā)現(xiàn)GB浸泡處理可以較好地保持桃果實的細胞膜的完整性，減少冷害的發(fā)生。綜上所述，CS和GB處理作為安全有效的果蔬采后保鮮技術(shù)已備受研究者的關(guān)注。目前已有研究證實10 mmol/L GB處理可以顯著減輕西葫蘆冷害發(fā)生[8]，但是單獨CS以及GB+CS處理對西葫蘆冷害的影響鮮見研究報道。為此，本實驗比較了單獨GB、CS處理及兩者復合處理對西葫蘆冷害及能量代謝的影響，以探討二者復合處理減輕西葫蘆冷害的作用及其機理，為CS和GB復合處理在西葫蘆低溫貯運保鮮中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用‘亞歷山大’西葫蘆，挑選表面完好、大小一致、無機械損傷的西葫蘆用于后續(xù)實驗。

硫代巴比妥酸、丙酮、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、甲醇、聚乙烯吡咯烷酮、硝酸鈉、鉬酸銨、硝酸鈣南京杰汶達試劑器材有限公司；ATP、ADP、AMP、細胞色素c 上海源葉生物科技有限公司；GB、2,6-二氯酚靛酚 美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷 北京索萊寶科技有限公司；硫酸甲酯吩嗪、琥珀酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；其中甲醇為色譜純，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1600分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；H1850R型冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；DDS-11A電導儀 上海第二分析儀器廠；BSA124S型電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；MIR-253恒溫培養(yǎng)箱 日本SANYO公司；CR-400色差儀日本Konica Minolta公司；LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將挑好的西葫蘆隨機分為4 組，即用常溫去離子水（對照）、10 mmol/L GB（GB處理組）、0 ℃冰水混合物（CS處理組）、含10 mmol/L GB的0 ℃冰水混合物（GB+CS處理組）分別浸泡30 min。撈出晾干后裝入打過孔的聚乙烯保鮮袋，再平鋪于塑料筐置于溫度為（4±1）℃、相對濕度為80%～90%的恒溫箱內(nèi)。每個處理100 個果實，重復3 次。分別在貯藏3、6、9、12 d時取10 個果實測定品質(zhì)和生理指標，另取10 個果實置于20 ℃恒溫箱內(nèi)2 d后測定冷害指數(shù)。

1.3.2 測定指標

1.3.2.1 冷害指數(shù)、相對電導率和丙二醛含量的測定

西葫蘆的冷害指數(shù)根據(jù)冷害面積比例可以分為5 個等級，0級：沒有冷害癥狀；1級：0＜冷害面積比例＜25%；2級：25%≤冷害面積比例＜50%；3級：50%≤冷害面積比例＜75%；4級：75%≤冷害面積比例＜100%。冷害指數(shù)按公式（1）進行計算。

相對電導率的測定參照姚文思等[9]的方法，取西葫蘆赤道部位的果皮進行測定。丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸法，具體參照曹建康等[11]的方法，結(jié)果以鮮質(zhì)量計，單位為nmol/g。

1.3.2.2 葉綠素含量、a*和b*值的測定

西葫蘆葉綠素含量參考曹建康等[11]的方法進行測定，測定時只取西葫蘆赤道部位的果皮。

果皮色差的測定采用Massolo等[12]的方法，在西葫蘆赤道部位的果皮上采用CR-400色差儀測定9 個點的a*、b*值，最后取平均值。

1.3.2.3 能量水平的測定

能量水平的測定參考Liu Hai等[13]的方法，并略作調(diào)整。稱取2 g凍樣，加入6 mL 0.6 mol/L HClO4溶液充分研磨后于4 ℃ 10 000×g離心30 min，取2 mL上清液用1 mol/L KOH溶液調(diào)pH值至6.5～6.8，隨后用超純水定容至3 mL，過0.45 μm水相濾膜后進行高效液相色譜分析。色譜條件參照張正敏等[14]的方法，上樣量為20 μL。根據(jù)標準品的保留時間對樣品作定性分析，根據(jù)標準品的峰面積進行定量分析，ATP、ADP、AMP含量以鮮質(zhì)量計。能荷的計算見公式（2）。

式中：ATP、ADP、AMP分別表示其含量/（μg/g）。

1.3.2.4 能量代謝關(guān)鍵酶活力的測定

西葫蘆線粒體的提取參照Liang Wusheng等[15]的方法并略做修改。稱取4 g冷凍果肉，加入10 mL提取液（含50 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、0.5 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮），低溫冰浴研磨，5 層紗布過濾至離心管，4 ℃ 12 000×g離心25 min，取上清液繼續(xù)離心25 min，去上清液，用4 mL洗脫液（含有10 mmol/L pH 7.2的Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA）洗滌沉淀，離心25 min，得到的沉淀即為線粒體，用2 mL洗脫液對沉淀進行懸浮溶解，置于低溫條件下備用。H+-ATPase和Ca2+-ATPase活力的測定參照Jin Peng等[16]的方法，最終以每克鮮質(zhì)量樣品每分鐘釋放1 μmol無機磷所需要的酶量作為一個酶活力（U），無機磷濃度的測定使用無機磷測試盒。琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活力的測定參照Ackrell等[17]的方法，線粒體細胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）活力參照Veitch等[18]的方法測定，以每克鮮質(zhì)量組織每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活力單位（U）。以上酶活力單位均為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以上指標測定均取3 個平行樣，并進行3 次重復測定。采用Excel和SPSS 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行計算分析，采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷激結(jié)合甜菜堿處理對西葫蘆冷害指數(shù)、相對電導率和MDA含量的影響

冷害指數(shù)是反映西葫蘆冷害程度的主要指標。由圖1A可知，隨著貯藏時間的延長，各組西葫蘆的冷害指數(shù)都呈逐漸增加的趨勢。GB、CS單獨處理和GB+CS復合處理均能有效延緩西葫蘆冷害指數(shù)的增加。低溫貯藏3 d后，對照組開始出現(xiàn)輕微凹陷斑，隨著貯藏時間的延長，各組西葫蘆冷害指數(shù)均持續(xù)增加，貯藏的第12天，GB、CS和GB+CS處理組西葫蘆的冷害指數(shù)分別為對照組的80%、73%和65%。整個貯藏過程中GB+CS復合處理的西葫蘆冷害指數(shù)始終低于其他3 組，這表明GB、CS處理和復合處理均能減輕西葫蘆的冷害，延長貨架期，且復合處理的效果優(yōu)于單獨處理。

圖1 不同處理對貯藏期西葫蘆冷害指數(shù)（A）、相對電導率（B）和MDA含量（C）的影響Fig. 1 Effects of different treatments on chilling injury index (A), relative electric conductivity (B) and MDA content (C) of zucchini during storage

植物受到低溫脅迫時，細胞膜受到損傷，細胞膜透性增大，相對電導率升高。整個貯藏期間，西葫蘆的相對電導率呈上升趨勢（圖1B），3 種處理都抑制了西葫蘆相對電導率的上升，對照組果實的相對電導率始終高于3 個處理組，GB+CS復合處理組的果實相對電導率始終最低。說明復合處理能最好地保持細胞完整性，減少電解質(zhì)的泄漏。

MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，植物在受到低溫脅迫時，膜脂過氧化作用加強，MDA積累。如圖1C所示，西葫蘆的MDA含量在整個貯藏期不斷增加，對照組西葫蘆的MDA含量急劇上升，而其他3 個處理組的趨勢較平緩且始終低于對照組，其中GB+CS復合處理組的MDA含量最低。貯藏第9天時，復合處理組MDA含量僅為對照組的64%。由此表明復合處理可更好地抑制膜脂的過氧化作用，降低MDA的積累。

2.2 冷激結(jié)合甜菜堿處理對西葫蘆葉綠素含量、a*和b*值的影響

圖2 不同處理對貯藏期西葫蘆葉綠素含量（A）、果皮色差a*（ BB） 和b*（C）值的影響Fig. 2 Effects of different treatments on chlorophyll content (A),a* value (B) and b* value (C) of zucchini during storage

西葫蘆貯藏期間葉綠素易發(fā)生降解，呈現(xiàn)類胡蘿卜素的顏色，使果實變黃，從而影響其商品價值。如圖2A所示，整個貯藏期間西葫蘆果皮葉綠素含量呈下降趨勢，GB、CS和GB+CS復合處理能抑制西葫蘆葉綠素含量的下降，其中GB+CS復合處理組的果實葉綠素含量最高。貯藏到第12天，對照組西葫蘆葉綠素含量下降至0.095 mg/g，GB、CS和GB+CS復合處理組的葉綠素含量分別為對照組的1.45、1.60 倍和1.71 倍。說明了GB+CS復合處理可延緩西葫蘆葉綠素含量的降低，使其保持良好的色澤。

a*值為負代表果皮顏色偏綠，絕對值越大果皮越綠，b*值為正代表果皮偏黃，值越大果皮越黃。由圖2B、C可知，貯藏期間西葫蘆的a*、b*值均持續(xù)增加，且整個貯藏過程中各處理組西葫蘆的a*、b*值均低于對照組，其中GB+CS復合組西葫蘆的a*、b*值最低且增加趨勢最緩慢。與葉綠素含量的變化結(jié)果一致，都表明了相對其他處理，復合處理能更好地維持西葫蘆表皮翠綠色澤。

2.3 冷激結(jié)合甜菜堿處理對西葫蘆能量水平的影響

圖3 不同處理對貯藏期西葫蘆ATP（A）、ADP（B）、AMP（C）含量和能荷（D）的影響Fig. 3 Effects of different treatments on ATP (A), ADP (B) and AMP (C)contents and energy charge (D) of zucchini during storage

能量是生物體生命活動的基礎(chǔ)，低溫脅迫會導致細胞膜受損，線粒體功能紊亂而降低能量水平。如圖3A所示，西葫蘆ATP含量在貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，貯藏6 d后，GB、CS和GB+CS復合處理的ATP含量均高于對照組，復合處理組的西葫蘆ATP含量最高。在第6天時，GB、CS、GB+CS復合處理組的ATP含量分別達到了22.97、17.62、28.52 μg/g，而對照組僅有10.04 μg/g。

由圖3B可知，ADP含量變化與ATP相類似，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，3 個處理組西葫蘆均保持較高的ADP含量，其中GB+CS復合處理組的ADP含量最高。貯藏第9天時，GB、CS、GB+CS復合處理組的ADP含量分別為對照組的1.1、1.2 倍和1.5 倍。

從圖3C可以看出，在整個貯藏期間西葫蘆的AMP含量逐漸增加，對照組果實內(nèi)的AMP含量始終高于其他3 組，GB、CS、GB+CS復合處理可以抑制果實內(nèi)AMP含量的增加，其中GB+CS復合處理抑制效果最好，在貯藏末期（12 d），GB+CS復合處理組的AMP含量僅為對照組的69%，明顯低于同期其他處理組。

如圖3D所示，3 個處理組的能荷在前6 d緩慢增加，后6 d逐漸下降，始終高于對照組，復合處理組能荷水平最高。說明3 種處理都可以通過提高西葫蘆內(nèi)ATP、ADP含量，降低AMP含量來保持較高的能荷水平，其中GB+CS復合處理效果最佳。

2.4 冷激結(jié)合甜菜堿處理對能量代謝關(guān)鍵酶的影響

圖4 不同處理對貯藏期西葫蘆Ca2＋-ATPase（A）、HH＋-ATPase（B）、SDH（C）和CCO（D）活力的影響Fig. 4 Effects of different treatments on the activities of Ca2+-ATPase (A), H+-ATPase (B), SDH (C) and CCO (D) of zucchini during storage

Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH和CCO是能量代謝的關(guān)鍵酶，這4 種酶活力的高低與能量水平密切相關(guān)。如圖4所示，貯藏期間西葫蘆內(nèi)4 種酶活力都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。經(jīng)過處理的西葫蘆內(nèi)的Ca2+-ATPase活力都高于對照組，且復合處理效果好于單一處理；貯藏的第12天，GB、CS和GB+CS復合處理的Ca2+-ATPase活力分別為0.515、0.543、0.618 U /g，而對照組酶活力僅有0.453 U /g（圖4A）。對照組西葫蘆內(nèi)H+-ATPase活力最低，GB、CS和GB+CS復合處理組都能保持較高的酶活力；復合處理組的H+-ATPase活力與對照組差異最大，貯藏第6天，復合處理組H+-ATPase活力比對照組高55.0%（圖4B）。經(jīng)過處理的西葫蘆內(nèi)的SDH活力始終高于對照組，CS、GB處理組與復合處理組的SDH活力最大，分別為2.225、2.125、2.475 U/g，對照組僅為1.725 U/g。果實內(nèi)CCO活力也是對照組最低，GB+CS復合處理組的酶活力始終最高，與對照組差異明顯，貯藏第12天時，GB、CS處理與復合處理組的CCO活力分別比對照組高21%、18%、26%。以上結(jié)果表明了GB、CS以及GB+CS復合處理均可提高果實內(nèi)Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH和CCO的活力，維持西葫蘆內(nèi)較高的能荷水平，其中以GB+CS處理的效果最好。

3 討 論

低溫貯藏是果蔬保鮮常用的方法，但西葫蘆在低溫運輸貯藏時極易發(fā)生冷害，極大地限制了西葫蘆的冷鏈貯運。已有研究發(fā)現(xiàn)單獨GB處理可以顯著降低西葫蘆在低溫貯藏期間的冷害指數(shù)[9]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GB、CS和GB+CS復合處理都能顯著減輕西葫蘆的冷害癥狀，延長貯藏期，且GB+CS復合處理的效果最為顯著。由于GB+CS復合處理簡單易行，且可起到預冷的作用，因而在西葫蘆冷鏈貯運中具較好的應用前景。

相對電導率與MDA含量是反映釆后果實細胞完整性的重要指標，在受到冷脅迫時，植物細胞膜會從液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，導致膜透性增大，相對電導率升高，MDA大量積累[19]。西葫蘆貯藏期間葉綠素不斷降解，果皮發(fā)黃，影響商品價值。朱賽賽等[20]用熱空氣處理西葫蘆的研究結(jié)果表明，熱空氣處理可以降低西葫蘆的冷害指數(shù)，緩解果實葉綠素含量的損失，減緩了MDA含量與相對電導率的上升。范林林等[21]發(fā)現(xiàn)，1-甲基環(huán)丙烯處理可明顯減輕西葫蘆的冷害癥狀，抑制MDA的積累，并較好地保持了細胞膜的完整性。程晨[22]、王清[23]、李春暉[24]等分別研究不同溫度對貯藏期西葫蘆冷害的影響時也都發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。本實驗發(fā)現(xiàn)，GB、CS和GB+CS復合處理都可以延緩西葫蘆相對電導率與MDA含量的上升，延緩葉綠素含量的下降和a*、b*值的增加。說明這3 種處理都可以降低西葫蘆的冷害指數(shù)，保持細胞膜完整性和西葫蘆表皮良好的色澤，其中復合處理效果最佳。

當植物受到逆境脅迫時，細胞因線粒體呼吸鏈受損，導致ATP合成下降，使細胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞[25]。前人的研究表明了能量不足導致膜結(jié)構(gòu)破壞與果蔬冷害的發(fā)生密切相關(guān)[26]。有研究報道經(jīng)過g-氨基丁酸處理的西葫蘆內(nèi)的ATP含量保持在較高的水平，其冷害指數(shù)也降低[27]。4 ℃或在15 ℃下預處理48 h可改善西葫蘆內(nèi)的能量狀態(tài)，增加ATP、ADP含量，并保持較高的能荷水平，減輕冷害癥狀[28]。Liu Zhanli等[29]發(fā)現(xiàn)2,4-表油菜素內(nèi)酯處理能夠保持采后竹筍內(nèi)的ATP、ADP含量和能荷水平，延緩AMP含量的上升，從而提高其能量水平，增強竹筍對冷害的耐受能力。在本實驗中，相對于對照組，3 種處理的西葫蘆體內(nèi)均保持較高的ATP含量、ADP含量、能荷水平和較低的AMP含量，其中以GB+CS處理的效果最佳。說明復合處理可以通過維持細胞內(nèi)較高的能荷水平提高西葫蘆的抗冷性，延長貨架期。

Ca2+-ATPase在細胞膜上起的是鈣泵的作用，維持細胞鈣穩(wěn)態(tài)，可以保持細胞膜的完整性。而H+-ATPase起的是質(zhì)子泵的作用，可以跨膜轉(zhuǎn)運H+并產(chǎn)生能量用于合成ATP[30]。SDH是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，它可以催化琥珀酸脫氫轉(zhuǎn)化為延胡索酸，并生成ATP。CCO是位于線粒體內(nèi)膜上的一種血紅蛋白，它將細胞色素c上的電子傳遞給氧氣，在能量代謝中起著關(guān)鍵作用[25]。大量研究發(fā)現(xiàn)這4 種酶活力與冷害有密切的關(guān)系。Pan Yonggui等[31]在研究GB處理對木瓜冷害的影響時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過GB處理的果實內(nèi)Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH和CCO活力顯著高于對照組，使木瓜果實內(nèi)保持較高的能荷水平從而延緩冷害的發(fā)生。低溫預貯可保持枇杷果實較高的Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH和CCO活力，從而降低其冷害的發(fā)生[32]。本實驗中，與對照相比，GB、CS和二者復合處理均可提高西葫蘆內(nèi)Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH與CCO的活力，GB+CS處理的西葫蘆4 種酶活力最高，這也與西葫蘆在貯藏期間內(nèi)的能荷水平的結(jié)果相同。表明GB+CS復合處理可以通過保持西葫蘆內(nèi)較高的能量代謝相關(guān)酶活力，來提高能荷水平，延緩冷害的發(fā)生。

4 結(jié) 論

GB、CS和GB+CS復合處理可以通過提高西葫蘆內(nèi)Ca2+-ATPase、H+-ATPase、SDH與CCO 4 種酶活力，維持較高的ATP、ADP含量和較低的AMP含量，保持果實內(nèi)較高的能荷水平，使西葫蘆在冷藏期間能夠維持正常的能量供給，從而顯著降低其冷害的發(fā)生，保持較好的貯藏品質(zhì)，其中以GB+CS復合處理的效果最佳。