時 佳，趙新淮*

（東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

蛋白質糖基化是將親水的碳水化合物（單糖、寡糖）共價連接到蛋白質分子上，從而改變蛋白質的結構、構象、凈電荷、疏水性等性質，最終實現(xiàn)蛋白質功能性質的改變，如溶解性、表面性質、吸水性、膠凝性以及熱穩(wěn)定性等。美拉德反應是實現(xiàn)蛋白質糖基化的最常用途徑之一[1-2]。例如，燕麥分離蛋白和蘑菇β-葡聚糖發(fā)生美拉德糖基化反應，修飾后的燕麥分離蛋白的溶解性、乳化活性和熱穩(wěn)定性都得到改善[3]。大米蛋白和葡聚糖發(fā)生美拉德糖基化反應后，其溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、起泡能力和泡沫穩(wěn)定性顯著增強[4]。利用美拉德反應和柑橘果膠發(fā)生糖基化反應，所得乳清分離蛋白-果膠復合物的乳化活性得到改善[5]。另外，蛋白質的糖基化反應對蛋白質的某些生物活性也有影響。例如，葡萄糖糖基化的豌豆7S球蛋白有更低的抗體親和性，對Caco-2單層細胞的毒性和轉運能力也降低[6]；乳糖糖基化的酪蛋白具有較低的體外免疫活性[7]，但晚期糖基化末端產(chǎn)物對人體免疫細胞具有直接的毒性作用[8]。因此，蛋白質的美拉德糖基化反應的其他不良影響，如對動物免疫狀況的影響，需要進一步研究。

免疫系統(tǒng)是動物機體的重要防御系統(tǒng)，可特異性或非特異性排除侵入機體的異物。動物的免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞與免疫分子組成。蛋白質是動物免疫系統(tǒng)和免疫反應的物質基礎。蛋白質水平低或氨基酸組成不合理都會影響動物的免疫狀況。蛋白質可以有效提高機體的免疫應答和特異性抗體水平，促進免疫器官發(fā)育、淋巴細胞增殖以及降低遲發(fā)性過敏反應[9-11]。然而，在正常小鼠模型中，美拉德糖基化反應對酪蛋白消化物的免疫活性是否有不良的影響或副作用，尚鮮見相關研究報道。因此，本研究利用乳糖和酪蛋白制備糖基化酪蛋白，胰蛋白酶消化制備酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物，評估糖基化酪蛋白消化物對正常小鼠免疫狀況的作用，并與酪蛋白消化物作用對比，揭示美拉德糖基化反應對酪蛋白消化物免疫活性的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雌性BALB/c小鼠（6～8 周齡；生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001，使用許可證號：SYXK（黑）2016-007）和飼料 北京維通利華實驗動物技術有限公司；小鼠淋巴瘤YAC-1細胞 中國科學院細胞庫。動物實驗按照哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物準則執(zhí)行。

酪蛋白、乳糖、刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（比酶活力120 kU/g） 北京奧博星生物技術有限公司；臺盼藍 美國Amresco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 加拿大Wisent公司；其他化學試劑均為分析純。酶法測定半乳糖試劑盒 美國BioAssay Systems公司；CCK-8檢測試劑盒 日本Dojindo公司；鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）（IgM、IgA、IgG）檢測試劑盒 南京建成生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

DELTA 320型精密pH計、AL204型電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HF-90型CO2培養(yǎng)箱 美國力康公司；Model 680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；DXC 800自動生化分析儀 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 乳糖糖基化酪蛋白消化物的制備

取一定量乳糖均勻分散于60 g/L酪蛋白溶液中，使乳糖和酪蛋白質量比為1.6∶1，調整酪蛋白終質量濃度為50 g/L、溶液pH 6.8。將反應物于沸水浴（100 ℃）中反應3 h，然后將樣品在冰浴中迅速冷卻至室溫。調整溶液pH值至4.5，4 000×g離心10 min，收集沉淀，pH 4.5下水洗2 遍，所得沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液調至中性，冷凍干燥后粉碎得到糖基化酪蛋白（乳糖含量（13.2±0.4）g/kg pro）。

用去離子水配制質量濃度為50 g/L的酪蛋白溶液和糖基化酪蛋白溶液，調整溶液pH 7.0，然后分別加入7 kU/g pro胰蛋白酶，37 ℃水解4 h，沸水浴滅酶5 min，快速冷卻至20 ℃，再用0.5 mol/L NaOH溶液調整pH 7.0，冷凍干燥粉碎后得到酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物（乳糖含量（10.6±0.3）g/kg pro）。

1.3.2 化學指標測定

蛋白含量：用凱氏定氮法測定樣品含氮量，轉換因子為6.38。

乳糖含量：按照文獻[12]方法測定乳糖含量。稱取一定量樣品于安瓿瓶，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，100 ℃水解4 h，冷卻至20 ℃，用0.1 mol/L NaOH溶液調整pH值至7.0，用半乳糖檢測試劑盒測定水解液半乳糖濃度，然后換算為樣品中的乳糖含量。

1.3.3 小鼠分組

雌性BALB/c小鼠70 只，適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為7 組：空白組和6 個實驗組，每組10 只?？瞻捉M小鼠每天灌胃生理鹽水，實驗組小鼠每天給予3 種劑量的酪蛋白消化物或糖蛋白消化物（低、中、高劑量分別為100、200 mg/kg mb和400 mg/kg mb），持續(xù)28 d。

1.3.4 血清生化指標和免疫球蛋白分析

小鼠末次灌胃24 h后，稱體質量，眼球采血。血液樣品于2 000×g離心10 min，用DXC 800自動生化分析儀測定血清生化指標。收集血清樣品用相應試劑盒按照說明書操作步驟測定IgM、IgA、IgG質量濃度。

1.3.5 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)測定

小鼠眼球取血后，脫頸處死，剖取脾臟和胸腺，稱濕質量，分別按式（1）、（2）計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.3.6 脾淋巴細胞增殖實驗

無菌條件下將各組小鼠剖腹、取出脾臟，剪成小塊置于200 目不銹鋼網(wǎng)篩，篩網(wǎng)中央浸沒于盛有Hank’s液的平皿中。無菌注射器芯研磨脾臟組織，用Hank’s液把網(wǎng)篩上剩余組織吹洗掉，收集脾臟組織懸液于無菌離心管，199×g下離心5 min，棄去上清液。加入3 mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置3 min，199×g離心5 min，棄去上清液；RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞制成單細胞懸液，通過臺盼藍實驗計算細胞數(shù)，活細胞比例不少于95%，調整細胞數(shù)為2×105個/mL。

將200 μL脾細胞懸液接種于96 孔板，同時加20 μL ConA（終質量濃度為5 μg/mL），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h；加入20 μL CCK-8，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)4 h；然后用酶標儀在450 nm波長處測定光密度值。以不添加脾細胞添加RPMI-1640培養(yǎng)液作空白孔。脾淋巴細胞增殖指數(shù)按式（3）計算[13]。

1.3.7 自然殺傷細胞活力分析

將靶細胞YAC-1細胞用RPMI培養(yǎng)液（含有體積分數(shù)10% FBS）調整細胞濃度至1×104個/mL。將脾細胞懸液（5×105個/mL）和靶細胞懸液（1×104個/mL）各100 μL/孔接種于96 孔板，同時設定效應細胞和靶細胞實驗孔。細胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后，加入15 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀于450 nm波長處測定各孔光密度值。自然殺傷（natural killer，NK）細胞活力按式（4）計算[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 16.0軟件中的單因素方差分析和Duncan’s多重比較法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，確定各組間數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 兩種酪蛋白消化物對小鼠血清生化指標的影響

本實驗中兩種酪蛋白消化物對小鼠血清17 項生化指標的影響如表1所示。與空白組小鼠相比，糖基化酪蛋白消化物組小鼠血清各項指標均增加，表明糖基化酪蛋白消化物改善了小鼠生理狀況。然而，與酪蛋白消化物相比，糖基化酪蛋白消化物對小鼠生理狀況的改善程度要低一些，在小鼠體內(nèi)糖基化酪蛋白消化物的活性低于酪蛋白消化物。這可能是由于美拉德反應破壞了蛋白質中賴氨酸等氨基酸[15-16]。因此，酪蛋白乳糖糖基化導致酪蛋白消化物在正常小鼠中的活性降低。

表1 兩種酪蛋白消化物對小鼠血清生化指標的影響Table 1 Serum biochemical indices of mice in response to the two digests

對于5 項重要生化指標（總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulin，GLO）、谷丙轉氨酶（alanine amiotransferase，ALT）和血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）），與空白組小鼠相比，酪蛋白消化物組小鼠血清TP質量濃度增加了9.8%～26.4%、ALB質量濃度增加了6.9%～26.0%、GLO質量濃度增加了8.1%～42.1%、ALT活力增加了11.1%～38.9%和BUN濃度增加了12.9%～29.0%。而糖基化酪蛋白消化物組小鼠血清5 項重要生化指標較空白組小鼠僅分別增加了7.9%～25.5%、6.3%～23.9%、3.4%～33.2%、7.4%～22.2%和3.2%～19.4%。兩種酪蛋白消化物處理組間，灌胃劑量為100 mg/kgmb時，小鼠血清BUN濃度差異顯著；灌胃劑量為200 mg/kgmb時，TP質量濃度、ALT活力和BUN濃度均差異顯著；灌胃劑量為400 mg/kgmb時，ALT活力和BUN濃度差異顯著。以上結果表明，酪蛋白消化物較糖基化酪蛋白消化物對正常小鼠具有更好的免疫提升效率。動物血清生化指標常用于反映實驗動物的生理代謝與健康狀況[17]。血清TP主要由血清GLO和血清ALB構成。TP在維持血管內(nèi)膠體滲透壓、運輸養(yǎng)分等功能中具有重要作用，可反映機體本身的營養(yǎng)狀況和對蛋白質的消化吸收情況，TP含量越高，表明機體合成蛋白質能力越強，即動物營養(yǎng)狀況良好[18]。ALT是檢測肝功能的重要指標。血清BUN為機體蛋白質和氨基酸等組分的代謝產(chǎn)物，是反映動物體內(nèi)蛋白質代謝和氨基酸平衡狀況的指標[19]。已有研究表明，膳食補充L-賴氨酸可通過影響血清生化指標調控機體免疫功能[20]。

2.2 兩種酪蛋白消化物對小鼠血清中Ig分泌的影響

圖1 兩種酪蛋白消化物對小鼠血清IgM（A）、IgA（B）和IgG（C）分泌的影響Fig. 1 Effects of the two digests on the levels of serum IgM (A), IgA (B),and IgG (C) of mice

由圖1可知，與空白組小鼠比較，酪蛋白消化物處理使小鼠血清IgM、IgA和IgG質量濃度分別增加了5.3%～29.6%、14.3%～44.5%和12.2%～31.7%，糖基化酪蛋白消化物處理使小鼠血清IgM、IgA和IgG質量濃度分別增加了3.9%～26.7%、9.9%～31.3%和2.26%～29.5%。酪蛋白消化物組小鼠與糖基化酪蛋白消化物組小鼠在灌胃劑量為200 mg/kg mb和400 mg/kg mb時，IgM質量濃度差異顯著；在灌胃劑量為100、200 mg/kg mb和400 mg/kg mb時，IgA和IgG質量濃度均有統(tǒng)計學差異。在同一劑量水平下，酪蛋白消化物顯示出比糖基化酪蛋白消化物更強的作用效果，證明酪蛋白的糖基化反應降低了酪蛋白消化物提升小鼠Ig分泌的能力。Ig是機體免疫系統(tǒng)的主要效應分子，由動物機體內(nèi)淋巴系統(tǒng)B細胞產(chǎn)生，其含量大小直接反映動物機體免疫應答能力的高低[21]。已有研究表明，鯉魚卵蛋白的胃蛋白酶水解物可以顯著提高小鼠IgA和IgG的分泌[22]；大豆低聚糖可以增加小鼠IgM、IgA和IgG的分泌[23]；酪蛋白肽通過促進Ig產(chǎn)生和免疫分子分泌，實現(xiàn)對機體免疫功能的調控作用[24-26]。以上實驗結果證明兩種酪蛋白消化物均對正常小鼠血清Ig分泌具有促進作用。

2.3 兩種酪蛋白消化物對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

圖2 兩種酪蛋白消化物對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig. 2 Effects of the two digests on immune organ indices of mice

由圖2可知，與空白組小鼠比較，給予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，各劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。酪蛋白消化物處理導致小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)較空白組小鼠分別增加了21.0%～37.4%和38.2%～74.0%，而糖基化酪蛋白消化物處理導致小鼠兩種免疫器官指數(shù)較空白組小鼠分別增加13.1%～28.0%和25.2%～58.5%。在同一劑量水平下，酪蛋白消化物對兩種免疫器官指數(shù)的提升作用均強于糖基化酪蛋白消化物，并且均有統(tǒng)計學差異，證明酪蛋白的糖基化反應不利于酪蛋白消化物改善小鼠脾臟和胸腺的生長發(fā)育狀況。

脾臟是動物的外周免疫器官，富含T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞，是體液和細胞免疫的中心。胸腺是動物的一級免疫器官，對T細胞成熟和分化起作用[27]。因此，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)可直接反映機體免疫狀況。研究表明，毛霉發(fā)酵豆制品毛豆腐及其提取物可以增加正常小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高動物免疫狀況[28]。胃蛋白酶水解薏苡仁谷蛋白后，其水解物可以增加小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高動物免疫狀況[29]。本實驗結果與這些研究的結論一致。

2.4 兩種酪蛋白消化物對小鼠脾淋巴細胞增殖和NK細胞活力的影響

圖3 兩種酪蛋白消化物對小鼠淋巴細胞增殖和NK細胞活力的影響Fig. 3 Effects of the two digests on lymphocyte proliferation and NK cell activity in mice

由圖3可知，兩種酪蛋白消化物以劑量依賴方式促進小鼠脾淋巴細胞增殖和增強NK細胞活力。與空白組小鼠相比，酪蛋白消化物處理組小鼠脾淋巴細胞增殖指數(shù)和NK細胞活力分別提高了5.9%～42.0%和23.4%～63.0%，而糖基化酪蛋白消化物處理組小鼠僅分別提高了4.5%～36.2%和13.5%～53.4%。兩種酪蛋白消化物處理組小鼠相比，在灌胃劑量100 mg/kg mb時，僅NK細胞活力有統(tǒng)計學差異；在灌胃劑量200 mg/kg mb和400 mg/kg mb時，脾淋巴細胞增殖指數(shù)和NK細胞活力均有統(tǒng)計學差異。因此，糖基化酪蛋白消化物刺激小鼠脾細胞增殖的能力低于酪蛋白消化物，再次證明糖基化反應降低了酪蛋白消化物提升小鼠免疫細胞活性的作用。

脾淋巴細胞是機體內(nèi)重要的免疫細胞，其增殖和分化是機體免疫應答過程的一個重要階段。因此，通過對淋巴細胞增殖作用的評估可以間接證明動物機體的免疫水平[30]。NK細胞是重要的免疫效應細胞，與機體抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)有關[31]。已有研究結果表明，乳蛋白肽可以促進小鼠脾淋巴細胞增殖和提高NK細胞活力[32]。胃蛋白酶水解鯉魚卵蛋白后，其水解物顯著提高了小鼠脾淋巴細胞增殖作用和NK細胞活力[22]。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合水解乳清分離蛋白，其消化物均具有增強小鼠脾淋巴細胞增殖的作用[33]。這些結論為本實驗結果提供了科學依據(jù)。

3 結 論

本研究通過評估正常小鼠的17 項血清生化指標、3 種血清Ig質量濃度、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、淋巴細胞增殖指數(shù)、NK細胞活力等重要免疫學指標，明確了酪蛋白的美拉德乳糖糖基化反應對酪蛋白消化物的不利影響。實驗結果表明，正常小鼠分別給予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，雖然免疫狀況均得到提升，各指標數(shù)值增加，但酪蛋白消化物具有比糖基化酪蛋白消化物更好的免疫提升效率。因此，本研究結果揭示酪蛋白的美拉德乳糖糖基化反應對酪蛋白消化物的體內(nèi)免疫提升活性有不良影響?？紤]蛋白質的美拉德糖基化反應可能降低蛋白質消化物的免疫活性，而乳品加工過程中乳蛋白和乳糖之間的美拉德反應不可避免，因此，控制乳制品加工處理過程中的美拉德反應具有重要意義和必要性。