來思彤，崔清亮,*，劉金龍，劉俊麗，孫 燈

（1.山西農(nóng)業(yè)大學工學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學文理學院，山西 太谷 030801）

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是豆科草本植物，在我國種植范圍廣、產(chǎn)量高[1]。苜蓿含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、免疫活性多糖、膳食纖維等營養(yǎng)成分，具有延緩衰老、預防便秘、降“三高”的功能[2-3]。國外已經(jīng)關(guān)注到苜蓿的食用價值，對苜蓿中的蛋白質(zhì)和色素進行了大量研究[4-5]。在我國苜蓿資源主要用做動物飼料[6]，研究人員也逐漸關(guān)注到它的食用價值，對苜蓿中的黃酮、蛋白質(zhì)等成分進行了研究[7-8]，但鮮見關(guān)于膳食纖維的相關(guān)報道。膳食纖維呈多羥基、疏松多孔結(jié)構(gòu)，具有良好的吸附特性。持水力、膨脹力反映膳食纖維對水分子的吸附能力，吸附水分子后體積膨脹，引起飽腹感，促進腸道蠕動，有利于預防肥胖和結(jié)腸癌。持油力反映膳食纖維對油脂的吸附能力，吸附油脂后隨膳食纖維排出體外，有利于降血脂。對膽固醇、亞硝酸鈉的吸附能力能反映膳食纖維對有害物質(zhì)的吸附能力，吸附有害物質(zhì)后可降低體內(nèi)有害物質(zhì)的濃度，從而有效預防冠心病[9]、癌癥[10]等疾病。膳食纖維含有羥基、羧基、氨基等側(cè)鏈基團，能和Ca2+、Pb2+、Cu2+、Na+、K+等離子進行可逆交換。膳食纖維與陽離子進行交換，有利于維持腸道內(nèi)的pH值、滲透壓[11]，降低血液中Na+/K+濃度，起到降血壓的作用[12]。隨著人們對膳食纖維生理功能的關(guān)注，2015年，英國的一個顧問委員會建議將膳食纖維的攝入量增加至30 g/d，但目前全世界大多數(shù)人由于食用精加工食物，膳食纖維的攝入量不到20 g/d[13]。

本研究對苜蓿不同部位莖葉的基本成分和不同粒度苜蓿葉粉的持水力、持油力、膨脹力、陽離子交換能力、對膽固醇的吸附能力、對亞硝酸鈉的吸附能力進行測定與分析，對不同粒度苜蓿葉粉的比表面積、孔徑、化學基團、表面微觀結(jié)構(gòu)進行觀察與測定，得出功能特性最佳時的粉碎粒度，為苜蓿膳食纖維功能食品的開發(fā)提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苜蓿：采自山西農(nóng)業(yè)大學牧草實踐教學基地，品種為金皇后，初花期時留茬約5 cm進行采樣。

葡萄糖標準品、膽固醇標準品 合肥博美生物科技有限公司；亞硝酸鈉標準品 北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)責任有限公司；耐高溫α-淀粉酶液、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶 上海金穗生物科技有限公司；溴化鉀（光譜純） 天津布蘭頓科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分級篩（0.25、0.2、0.16、0.125、0.08、0.063 mm的編織方孔篩） 浙江上虞市華豐五金有限公司；SKD-800凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；Spectrum Two N傅里葉變換近紅外光譜儀 美國PerkinElmer股份有限公司；比表面積及孔徑分析儀貝士德儀器科技（北京）有限公司；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

以采樣后的苜蓿底端為起點進行測量，在植株30、60、90 cm處進行分段，將植株分為下（0～30 cm）、中（30～60 cm）、上（大于60 cm）3 段；分別對每段苜蓿進行莖葉分離，將植株分為上部葉片、上部莖稈、中部葉片、中部莖稈、下部葉片、下部莖稈6 個部分；分別對6 個部分進行沖洗、干燥（55 ℃）、粉碎、過篩（80 目）得6 個樣品，自封袋內(nèi)避光保存，用于測定苜蓿不同部位的基本成分。

上部葉片經(jīng)沖洗、干燥、粉碎后，依次過0.25、0.2、0.16、0.125、0.08、0.063 mm方孔編織篩進行分級，分成粉碎粒度不同的苜蓿葉粉，分別記為G1（粒度0.20～0.25 mm）、G2（粒度0.16～0.20 mm）、G3（粒度0.125～0.160 mm）、G4（粒度0.080～0.125 mm）、G5（粒度0.063～0.080 mm），共5 組樣品，自封袋內(nèi)避光保存，用于不同粒度苜蓿葉粉的功能特性指標的測定與分析。

1.3.2 苜蓿不同部位莖葉的基本成分測定

水分質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》直接干燥法；灰分質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》高溫灼燒法；蛋白質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法；脂肪質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》索氏抽提法；膳食纖維質(zhì)量分數(shù)的測定采用GB 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》酶重量法；粗多糖質(zhì)量分數(shù)的測定采用SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定苯酚-硫酸法》。

1.3.3 不同粒度苜蓿葉粉的功能特性指標測定

1.3.3.1 持水力、持油力、膨脹力測定

持水力、持油力參照郭增旺等[14]的方法進行測定；膨脹力參照王大為等[15]的方法進行測定。

1.3.3.2 陽離子交換能力測定

陽離子交換能力的測定參照孟滿等[16]的方法，繪制溶液pH值與加入NaOH溶液體積之間的關(guān)系圖。稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中，加50 mL 0.1 mol/L的鹽酸，充分混合，室溫條件密封靜置12 h，過濾，蒸餾水沖洗至中性并且不含氯離子（質(zhì)量分數(shù)為10%的AgNO3溶液進行鑒定），55 ℃干燥。稱取干燥后的樣品0.25 g于三角瓶中，加質(zhì)量分數(shù)15% NaCl溶液100 mL，磁力攪拌30 min，每次加0.1 mol/L NaOH溶液0.2 mL，充分混合后，記錄此時溶液的pH值，直至pH值平穩(wěn)變化。隨NaOH溶液添加量的增加，溶液的pH值變化越緩慢，說明樣品的陽離子交換能力越強。

1.3.3.3 吸附膽固醇能力測定

參照陸紅佳[17]的方法，繪制以膽固醇質(zhì)量濃度/（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標的標準曲線。取新鮮雞蛋黃一個，加入500 mL蒸餾水充分攪拌至乳液，取1 mL樣液，按標準曲線測定方法測其膽固醇質(zhì)量（m0/mg）。

吸附能力的測定：稱取0.2 g樣品于15 mL離心管，加10 mL蛋黃液，調(diào)節(jié)pH值至2，充分振蕩，于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩2 h，4 000 r/min離心20 min，取1 mL上清液，按上述方法測其膽固醇質(zhì)量（m1/mg）。按上述步驟，將pH值調(diào)節(jié)至7，重新進行實驗。吸附膽固醇能力按式（1）計算。

式中：m為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.3.4 吸附亞硝酸鈉能力的測定

采用GB 5009.33—2016《食品中硝酸鹽與亞硝酸鹽的測定》分光光度法，繪制以亞硝酸鈉質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標的標準曲線。

稱取樣品0.1 g于離心管中，加5.0 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液10 mL，調(diào)節(jié)pH值至2，于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩2 h，4 000 r/min離心20 min，取1 mL上清液，按上述方法測亞硝酸鈉質(zhì)量濃度（ρ1/（μg/mL））。按上述步驟，將pH值調(diào)節(jié)至7，重新進行實驗。吸附亞硝酸鈉能力按式（2）計算。

式中：ρ0為所加亞硝酸鈉溶液的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為加入亞硝酸的體積/mL；m為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4 不同粒度苜蓿葉粉的結(jié)構(gòu)表征

1.3.4.1 比表面積及孔徑的測定

取大約2.0 g樣品，用比表面積及孔徑分析儀在55 ℃條件下脫氣3 h，稱質(zhì)量，77.3 K條件下對N2進行吸附和脫附，根據(jù)BET多點法、BJH法計算其比表面積、累積孔體積、最可幾孔直徑[18]。

1.3.4.2 化學基團的檢測

將樣品和KBr晶體進行干燥，稱取200 mg KBr晶體進行研磨，再加2 mg樣品充分混合、壓片[19]。用近紅外光譜儀在450～4 000 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進行掃描，根據(jù)峰出現(xiàn)的位置及峰值對苜蓿葉粉表面的化學基團進行分析。

1.3.4.3 表面結(jié)構(gòu)超微觀察與分析

樣品干燥后，固定并噴金，用掃描電子顯微鏡對其表面結(jié)構(gòu)進行觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有結(jié)果平行測定3 次，利用SAS 9.1軟件進行方差分析（P＜0.05），采用Origin 9.0軟件繪制折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿不同部位莖葉的基本成分

圖1 苜蓿不同部位莖葉的基本成分Fig. 1 Chemical components of alfalfa stems and leaves from different positions

由圖1可以看出，苜蓿莖稈和葉片的膳食纖維、蛋白質(zhì)、灰分、脂肪、粗多糖質(zhì)量分數(shù)存在顯著性差異，且不同部位間也存在顯著性差異（P＜0.05）。苜蓿莖稈和葉片中膳食纖維質(zhì)量分數(shù)均高于歐洲國家常用的麥麩纖維（47.09%）[20]；因此，苜蓿是膳食纖維的良好來源。葉片的蛋白質(zhì)、可溶性膳食纖維、灰分、脂肪、粗多糖質(zhì)量分數(shù)顯著高于莖稈（P＜0.05）；但莖稈的不溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)顯著高于葉片（P＜0.05）。根據(jù)膳食纖維質(zhì)量分數(shù)的特點，莖稈可用于開發(fā)預防肥胖類食品，葉片可用來開發(fā)預防冠心病、高血壓等疾病的食品[12]。苜蓿上部葉片中蛋白質(zhì)、可溶性膳食纖維、灰分、脂肪的質(zhì)量分數(shù)均高于其他部位，分別為28.62%、12.25%、11.35%、6.23%，其中可溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)是下部莖稈的5.89 倍，可溶性膳食纖維又是膳食纖維功能的主要成分[21]；因此，苜蓿上部葉片的營養(yǎng)價值相比其他部位營養(yǎng)價值更高。

2.2 不同粒度苜蓿葉粉的功能特性

2.2.1 持水力、持油力、膨脹力

圖2 不同粒度苜蓿葉粉的持水力、持油力、膨脹力Fig. 2 Water-holding capacity, oil-holding capacity and swelling capacity of alfalfa leaf powders with different particle sizes

由圖2可以看出，G1、G2、G3、G4、G5的持水力、持油力、膨脹力存在顯著性差異（P＜0.05）。隨著苜蓿葉粉碎粒度的減小，持水力、膨脹力先增大后減小，持油力逐漸減小。G3的持水力、膨脹為5.57 g/g、4.40 mL/g，較G1分別提高了16.53%、15.79%。G5的持油力（1.84 g/g）較G1（2.83 g/g）降低了34.98%。這是由于隨著苜蓿葉粉碎粒度減小，比表面積增大，表面親水基數(shù)量增加，使持水力和膨脹力增大，但粉碎粒度小于0.125 mm，苜蓿粉空間結(jié)構(gòu)被破壞，導致其對水的束縛力下降[22]。因此，當苜蓿葉的粉碎粒度為0.125～0.160 mm時，持水力、膨脹力達到最佳，能更好地分解長鏈脂肪酸、促進腸道蠕動、維持腸道的健康，有效預防肥胖和結(jié)腸癌[23-24]。

2.2.2 陽離子交換能力

圖3 不同粒度苜蓿葉粉的陽離子交換能力Fig. 3 Cation-exchange capacity of alfalfa leaf powders with different particle sizes

如圖3所示，隨著NaOH溶液的添加量從0.8 mL逐漸增加至1.8 mL，G5較G1、G2、G3、G4溶液pH值變化緩慢，說明G5能更好地維持環(huán)境中的pH值和滲透壓，具有較強的陽離子交換能力。NaOH溶液添加量為0.8～1.8 mL范圍時，G2和G3的陽離子交換能力差異不顯著，G4和G5的陽離子交換能力差異也不顯著，但兩組之間以及與G1的陽離子交換能力差異顯著（P＜0.05）。因此，苜蓿葉的粉碎粒度為0.063～0.125 mm（G4、G5）時，能更好地維持腸道的pH值和滲透壓、降低血壓、減少人體對脂肪和重金屬的吸收[17]。

2.2.3 對膽固醇的吸附能力

圖4 不同粒度苜蓿葉粉對膽固醇的吸附能力Fig. 4 Cholesterol adsorption capacity of alfalfa leaf powders with different particle sizes

由圖4可以看出，G1、G2、G3、G4、G5對膽固醇的吸附能力存在顯著性差異（P＜0.05）。G1、G2、G3、G4、G5在pH 7（模擬腸道）環(huán)境中的吸附能力是在pH 2（模擬胃）環(huán)境中吸附能力的1.6～3.1 倍，說明苜蓿葉粉在腸道中對膽固醇的吸附能力較強。在相同pH值環(huán)境中，G1、G2、G3、G4、G5對膽固醇的吸附能力依次增強，說明減小苜蓿葉的粉碎粒度可提高對膽固醇的吸附能力。因此，粉碎粒度為0.063～0.080 mm的苜蓿粉，可更有效地降低體內(nèi)膽固醇的濃度，預防冠心病[9]。

2.2.4 對亞硝酸鈉的吸附能力

圖5 不同粒度苜蓿葉粉對亞硝酸鈉的吸附能力Fig. 5 Sodium nitrite absorption capacity of alfalfa leaf powders with different particle sizes

由圖5可以看出，G1、G2、G3、G4、G5在pH 2環(huán)境（模擬胃）中對亞硝酸鈉的吸附能力存在顯著性差異（P＜0.05），在pH 7環(huán)境（模擬腸道）中G5對亞硝酸鈉的吸附能力顯著高于G1、G2、G3（P＜0.05）。G1、G2、G3、G4、G5在pH 2環(huán)境中的吸附能力是在pH 7環(huán)境中的4.1～4.6 倍，說明苜蓿葉粉在胃中對亞硝酸鈉的吸附能力較強，這是由于在酸性條件下，含羧基化合物解離，更有利于吸附的進行[25]。在相同pH值環(huán)境中，G1、G2、G3、G4、G5對亞硝酸鈉的吸附能力依次增強，說明減小苜蓿葉的粉碎粒度可提高其對亞硝酸鈉的吸附能力，這是由于苜蓿粉碎粒度的減小，部分不溶性膳食纖維鏈狀結(jié)構(gòu)被破環(huán)后轉(zhuǎn)化為可溶性膳食纖維，比表面積增大，表面有效基團數(shù)量增加，使得吸附能力增加[26]。因此，苜蓿葉的粉碎粒度為0.063～0.080 mm時，可更有效地降低人體內(nèi)亞硝酸鈉的濃度，預防癌癥[10]。

2.3 不同粒度苜蓿葉粉的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.3.1 比表面積及孔徑

表1 不同粉碎粒度苜蓿葉比表面積及孔徑Table 1 Speci fi c surface area and aperture of alfalfa leaf powders with different particle sizes

由表1可以看出，G1、G2、G3、G4、G5的比表面積、累積孔體積存在顯著性差異（P＜0.05）。G5的比表面積、累積孔體積較G1、G2、G3、G4顯著增大，但最可幾孔直徑較G4減小不顯著（P＞0.05）。G5較G1的比表面積、累積孔體積分別增加68.85%、49.73%，最可幾孔直徑減小5.99%。綜上可知，減小粉碎粒度可使苜蓿粉的比表面積、累積孔體積增大，最可幾孔直徑減小。

2.3.2 化學基團

圖6 不同粉碎粒度苜蓿葉的紅外光譜掃描圖Fig. 6 Infrared radiation spectra of alfalfa leaf powders with different particle sizes

由圖6可以看出，不同粒度苜蓿葉粉吸收峰的位置和形狀大體相似，說明粉碎不改變苜蓿葉粉表面基團的種類。但峰值的高低呈規(guī)律性變化，說明基團數(shù)量隨粉碎粒度而發(fā)生變化。苜蓿葉粉在3 367.25 cm－1處出現(xiàn)寬而強的吸收峰，透光率隨粉碎粒度的減小而下降。在3 200～3 400 cm－1范圍內(nèi)，G2、G3、G4、G5的透光率存在明顯差異，但G1與G2之間差異不明顯。結(jié)果表明，隨粉碎粒徑減小，羥基數(shù)增加，親水性增強。在2 920.16 cm－1和2 851.12 cm－1處出現(xiàn)吸收峰，說明苜蓿葉粉中有—CH2的存在。在1 652.35 cm－1處出現(xiàn)最強的吸收峰，說明有C＝O的存在。在1 072.33 cm－1處出現(xiàn)1 000～1 300 cm－1區(qū)域內(nèi)最強的吸收峰，說明有C—O的存在[27]。

2.3.3 表面結(jié)構(gòu)超微觀察與分析結(jié)果

圖7 不同粉碎粒度苜蓿葉表面超微結(jié)構(gòu)Fig. 7 Surface ultrastructure of alfalfa leaf powders with different particle sizes

由圖7A～E可以看出，隨著粉碎粒度的減小，表面的小碎片數(shù)量增加、尺寸變小且更加均勻；微孔的直徑減小、數(shù)量增加；這使得比表面積增大，表面基團數(shù)量增加，與比表面積及孔徑、化學基團的分析結(jié)果相同。由圖7E可以看出，當粉碎粒度小于0.08 mm時，表面部分粗糙結(jié)構(gòu)消失，呈現(xiàn)光滑狀。為進一步觀察表面結(jié)構(gòu)，將G5樣品放大6 000 倍進行觀察（圖7F），可以看出，表面粗糙不平，呈碎片狀，且碎片間存在孔隙，使得苜蓿粉具有較大的比表面積，可通過毛細管作用和化學鍵進行吸附，具有良好的吸附性能。

3 結(jié) 論

苜蓿作為膳食纖維的良好來源，上部葉片中蛋白質(zhì)、可溶性膳食纖維、灰分、脂肪的質(zhì)量分數(shù)均高于其他部位，分別為28.62%、12.25%、11.35%、6.23%，其中可溶性膳食纖維質(zhì)量分數(shù)是下部莖稈的5.89 倍，可溶性膳食纖維又是膳食纖維功能的主要成分；因此，苜蓿上部葉片相對其他部位營養(yǎng)價值更高。

隨著苜蓿葉粉碎粒度減小，各功能特性指標呈現(xiàn)不同的變化趨勢。苜蓿葉的粉碎粒度為0.125～0.160 mm時，具有較高的持水力、膨脹力，適合用于開發(fā)改善腸道功能、預防肥胖的食品；粉碎粒度為0.063～0.080 mm時，具有較高的吸附膽固醇的能力、吸附亞硝酸鈉能力和陽離子交換能力，適合用于開發(fā)預防高血壓、冠心病、癌癥的食品。

隨著粉碎粒度減小，苜蓿葉的比表面積增加，累積孔體積增大，最可幾孔直徑減小，部分基團數(shù)量增加，使得持水力、膨脹力、陽離子交換能力、吸附膽固醇的能力、吸附亞硝酸鈉的能力逐漸增加，這是由于比表面積增大，表面基團數(shù)量增加。但苜蓿葉粉碎粒度小于0.125 mm時，持水力、膨脹力反而開始下降，這可能是由于表面微孔直徑減小，截留作用減弱，進入微孔的水分子數(shù)量也減少，使得持水力、膨脹力下降。隨著苜蓿葉粉碎粒度的減小，持油力下降，這可能是由于最可幾孔直徑減小，親水基團數(shù)量增加，使得持油力下降。各功能特性指標隨粒度變化呈現(xiàn)不同的變化趨勢，根本原因可能是由于吸附方式不同，持油力主要靠物理吸附；陽離子交換能力、對膽固醇的吸附能力、對亞硝酸鈉的吸附能力主要靠化學吸附；而持水力和膨脹力靠物理吸附和化學吸附共同作用。