湯陳鵬，呂 峰*，王蓉琳

（福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

孔石莼（Ulva pertusa）又稱海菠菜、海條等，是一種隸屬于石莼科的大型綠藻；其風味鮮美、營養(yǎng)豐富，具有清熱解毒、軟堅散結等功效[1]?？资欢嗵鞘强资恢械闹饕锘钚晕镔|[2]，有關研究表明，孔石莼多糖具有降血糖[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]、抗腫瘤[6]等多種生物活性。

鋅是人體必需的微量元素之一[7]，在體內酶和受體功能的調節(jié)中起著重要的作用[8]。缺鋅可導致人體營養(yǎng)不良、皮膚炎癥、免疫力低下等一系列癥狀。近年來，國內外研究表明，將天然多糖與鋅進行絡合改性制備得到多糖鋅絡合物，與常見的無機補鋅劑相比，其生物利用率高、副作用小，且同時兼具多糖與鋅的生理功能，具有廣闊的應用前景[9]。目前已見報道的多糖鋅有酵母多糖鋅[10]、夏枯草多糖鋅[11]、竹蓀多糖鋅[12]、大米胚芽多糖鋅[13]、金針菇多糖鋅[14]等。

本研究以實驗室自制的孔石莼多糖為參照，對孔石莼多糖鋅絡合物的結構與體外降血糖活性進行表征與探究，以期為孔石莼資源的高值化利用和新型多糖補鋅劑的開發(fā)提供一定的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔石莼多糖、孔石莼多糖鋅（鋅質量分數10.24%），均為福建農林大學食品科學學院保鮮基地實驗室自制[15]。

α-葡萄糖苷酶（比活力50 U/mg）、α-淀粉酶（豬胰腺，比活力10 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）上海源葉生物科技有限公司；硫酸、剛果紅、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、可溶性淀粉、苯酚、氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）均為分析純。

1.2 儀器與設備

BSA223S分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；PHB-3 pH計 上海三信儀表廠；SYNERGY酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；HP-INNOWAX毛細管色譜柱、5500原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）、7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司；OHpak SB-806M HQ凝膠色譜柱 日本Shodex公司；DAWN HELEOS-II多角度激光光散射檢測器、OPtilab rex示差折光檢測器 美國Wyatt技術公司；UV2600紫外-可見分光光度計 日本島津儀器設備公司；Nicolet IS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher科技公司；X’ pert3 and Empyrean X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 荷蘭Panalytical公司；Nova NanoSEM 230場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 孔石莼多糖及其鋅絡合物的理化性質及結構表征

1.3.1.1 孔石莼多糖的單糖組成分析

采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）儀對孔石莼多糖的單糖組成進行分析，樣品的酸解糖腈乙?；苌磻獏⒖紖蚊飨糩16]的研究。色譜條件為色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣：N2；程序升溫：起始溫度190 ℃，2 ℃/min升至240 ℃后保持8 min，再以10 ℃/min升至260 ℃，保持2 min。質譜條件為：電子轟擊電離（70 eV），離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍：m/z 30～600。

1.3.1.2 總糖質量分數測定

孔石莼多糖及其鋅絡合物總糖含量的測定參考馮學珍等[17]的苯酚-硫酸法，并略作修改。繪制葡萄糖的標準曲線，并計算得到回歸方程，y＝0.005 9x+0.025 5（R2＝0.992 8），其中x為葡萄糖含量，y為溶液吸光度。

分別量取孔石莼多糖及其鋅絡合物樣液2.0 mL，加入質量分數6%的苯酚溶液1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，充分混勻，靜置冷卻30 min后，于490 nm波長處測定溶液的吸光度，根據葡萄糖標準曲線與吸光度計算得到兩者的總糖含量。

1.3.1.3 凝膠滲透色譜-多角度激光光散射-示差檢測器聯用法分析

采用凝膠滲透色譜-多角度激光光散射-示差檢測器體系（gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering-refractive index，GPC-MALLS-RI）對孔石莼多糖及其鋅絡合物的分子特征參數進行檢測[18-19]。色譜條件為色譜柱：OHpak SB-806M HQ；流動相：0.1 mol/L NaCl；流速：0.5 mL/min；進樣量：200 μL；樣品質量濃度：1 mg/mL。

1.3.1.4 剛果紅實驗

采用剛果紅實驗分析孔石莼多糖及其鋅絡合物的螺旋構象[20]。將孔石莼多糖及其鋅絡合物分別配制成質量濃度為1 mg/mL的待測樣液，分別與等體積的80 μmol/L剛果紅溶液混勻后，加入1 mol/L NaOH溶液，梯度調節(jié)混合溶液中NaOH的濃度為0～0.50 mol/L，濃度梯度為0.05 mol/L，并測定各個NaOH濃度下混合溶液的最大吸收波長；空白對照以相同體積的蒸餾水取代待測樣液，配制同樣濃度NaOH的剛果紅溶液，并測定其最大吸收波長。

1.3.1.5 紫外-可見光譜分析

分別稱取適量孔石莼多糖及其鋅絡合物樣品粉末，均配制成1 mg/mL的溶液，采用紫外-可見分光光度計進行掃描，對兩者的結構特征進行初步表征，掃描范圍為200～800 nm[21]。

1.3.1.6 傅里葉變換紅外光譜分析

分別稱取2 mg孔石莼多糖及其鋅絡合物樣品粉末，與適量溴化鉀粉末混合、研磨并壓制成薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm－1范圍內進行掃描[22]，探究孔石莼多糖及其鋅絡合物的官能團特征。

1.3.1.7 XRD分析

采用XRD儀研究孔石莼多糖及其鋅絡合物的結構狀態(tài)[23]。XRD條件為：管壓45 kV，管流40 mA，陽極為Cu靶，最小步長0.001°，發(fā)散狹縫0.76 mm，掃描速率5°/min。

1.3.1.8 SEM觀察

分別稱取一定量的孔石莼多糖及其鋅絡合物樣品粉末，粘著于樣品臺上，置于真空噴鍍儀內鍍導電膜，使用SEM對孔石莼多糖及其鋅絡合物的表面形貌進行觀察[24]。

1.3.1.9 AFM觀察

分別配制質量濃度為10 μg/mL的孔石莼多糖及其鋅絡合物溶液，各取5 μL樣液滴于新剝離的云母片表面，靜置，待其風干后采用AFM通過輕敲模式對兩者分子的微觀形貌進行觀測[25]。

1.3.2 孔石莼多糖鋅體外降血糖活性測定

1.3.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力測定

參考陳浩[26]的實驗方法，稍作修改。取孔石莼多糖及其鋅絡合物分別配制成質量濃度依次為5、10、15、20、25 mg/mL的待測樣液；采用100 mmol/L、pH 6.8的磷酸鈉緩沖液分別配制5 mmol/L的PNPG溶液與0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。分別移取50 μL待測樣液于96 孔板孔中，各加入50 μL PNPG溶液，于37 ℃下溫孵10 min，各加入50 μL α-葡萄糖苷酶溶液，置于酶標儀中37 ℃反應30 min后，于405 nm波長處測定其吸光度A1。以等體積蒸餾水取代待測溶液，測定其吸光度A0；以等體積磷酸鈉緩沖液取代α-葡萄糖苷酶溶液，測定其吸光度A2，以等體積蒸餾水和磷酸鈉緩沖液分別取代待測溶液和α-葡萄糖苷酶溶液，測定其吸光度A3。用式（1）計算抑制率。

1.3.2.2 α-淀粉酶抑制能力測定

采用DNS比色法[27]進行檢測，并略作修改。將孔石莼多糖及其鋅絡合物分別配制成質量濃度為5、10、15、20、25 mg/mL的待測樣液；采用25 mmol/L、pH 6.9的磷酸鹽緩沖液分別配制10 U/mL的α-淀粉酶溶液和質量分數1%的可溶性淀粉溶液。向各試管中分別加入300 μL不同質量濃度的待測溶液及300 μL的α-淀粉酶溶液，混合均勻，于37 ℃下溫孵15 min，再分別加入300 μL可溶性淀粉溶液開始反應，15 min后再各加入500 μL DNS試劑顯色，并立即煮沸滅酶10 min終止反應；將混合體系定容至10 mL，于540 nm波長處測定其吸光度A1。以等體積蒸餾水取代待測溶液，測定其吸光度A0；以等體積磷酸鹽緩沖液取代α-淀粉酶溶液，測定其吸光度A2，以等體積蒸餾水和磷酸鹽緩沖液分別取代待測溶液和α-淀粉酶溶液，測定其吸光度A3。用式（2）計算抑制率。

1.4 數據處理與統計分析

采用DPS V7.05軟件對實驗數據進行方差分析，各數據之間的多重比較使用最小顯著性差異法，其中，以P＞0.05為差異不顯著，P＜0.05為顯著，P＜0.01為極顯著。使用Microsoft Excel 2007軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 孔石莼多糖及其鋅絡合物的理化性質及結構表征

2.1.1 孔石莼多糖的單糖組成分析結果

采用GC-MS分析孔石莼多糖的單糖組成（圖1），通過與單糖標準品保留時間與離子碎片進行對比，確定孔石莼多糖是由鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖，其構成單糖基的物質的量比為1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07。

圖1 標準單糖（a）與孔石莼多糖（b）的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of monosaccharide standards (a) and Ulva pertusa polysaccharides (b)

2.1.2 總糖質量分數測定結果

苯酚-硫酸法測定孔石莼多糖及其鋅絡合物的總糖含量。經計算，孔石莼多糖和孔石莼多糖鋅中總糖質量分數分別為53.35%和49.40%，可以看出經過絡合鋅改性，孔石莼多糖中的總糖含量有所下降。

2.1.3 GPC-MALLS-RI分析結果

表1 孔石莼多糖及其鋅絡合物的分子特征參數Table 1 Molecular parameters of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

表1數據顯示，孔石莼多糖鋅的重均分子質量（Mw）為1.319×105g/mol，重均均方根旋轉半徑（Rw）為28.6 nm，均明顯低于孔石莼多糖的Mw（4.903×105g/mol）和Rw（35.6 nm），而多分散指數（Mw/Mn）為2.120，明顯高于孔石莼多糖的（1.607）。該結果說明經過絡合鋅反應，孔石莼多糖鋅的分子質量、分子尺寸明顯減小，而分子質量分布則較原多糖變寬，與Wei Dongfeng等[28]在制備紅芪多糖硒絡合物時得到的結果相似，推測可能是制備時反應體系使用稀鹽酸調節(jié)pH值，由于鹽酸為強酸，故導致絡合反應過程中部分多糖發(fā)生了降解。

圖2 孔石莼多糖（a）及其鋅絡合物（b）的空間構象Fig. 2 Spatial conformation of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)

圖2 為孔石莼多糖及其鋅絡合物的分子質量與均方根旋轉半徑之間的關系曲線圖，可顯示樣品的多糖鏈構象[29]。從圖2中可看出，孔石莼多糖及其鋅絡合物的譜圖線性關系均較差，兩者均呈類似U型的曲線，提示兩者的分子構象均為高支化度結構，該現象與曾紅亮[30]對金柑多糖的GPC-MALLS-RI分析結果類似。

2.1.4 剛果紅實驗結果

圖3 孔石莼多糖及其鋅絡合物與剛果紅反應體系的最大吸收波長Fig. 3 Congo-red reactions of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

剛果紅能夠與具有三螺旋結構的多糖發(fā)生絡合反應，與剛果紅溶液相比，絡合物的最大吸收波長發(fā)生紅移，并在一定的NaOH濃度范圍內呈現亞穩(wěn)性[31]。從圖3中可看出，剛果紅與孔石莼多糖混合后，其最大吸收波長發(fā)生了明顯的紅移，且在NaOH濃度0.15～0.50 mol/L范圍內無明顯變化，出現了亞穩(wěn)區(qū)，而剛果紅與孔石莼多糖鋅混合溶液的最大吸收波長則沒有出現這種特征的明顯變化。由此可推測孔石莼多糖具有三螺旋結構，而其鋅絡合物中的孔石莼多糖的三螺旋結構基本被破壞。

2.1.5 紫外-可見光譜分析結果

圖4 孔石莼多糖及其鋅絡合物的紫外-可見光譜圖Fig. 4 UV-VIS spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

由圖4可知，兩條曲線在260、280 nm波長處均無吸收峰，且孔石莼多糖鋅在紫外區(qū)的吸收強度明顯小于孔石莼多糖，說明孔石莼多糖及其鋅絡合物均基本不含有核酸和蛋白質，且絡合物中的生色基或助色基與Zn2+發(fā)生絡合反應[32]，形成了化學鍵束縛，從而導致紫外吸收強度有所減弱。

2.1.6 傅里葉變換紅外光譜分析結果

由圖5可知，孔石莼多糖在2 981.46 cm－1處的峰為甲基（—CH3）中C—H非對稱伸縮振動的吸收峰，1 621.20 cm－1處的峰為羧基（—COO－）中C＝O非對稱伸縮振動的吸收峰，1 230.86 cm－1處的峰為硫酸基（—OSO3－）中S＝O的伸縮振動峰；經過絡合鋅反應，這3 處峰分別移動至2 992.55 、1 632.91、1 215.40 cm－1處，提示絡合鋅改性對孔石莼多糖的這些基團造成了一定的影響；此外，圖4還顯示，孔石莼多糖鋅在1 391.89 cm－1與997.03 cm－1處較其原多糖多出兩個特征峰。綜上可知，孔石莼多糖絡合鋅的反應主要體現在其糖鏈上的—COO－、—CH3、—OSO3－等基團與Zn2+發(fā)生反應，而非簡單的物理混合。

圖5 孔石莼多糖及其鋅絡合物的傅里葉變換紅外光譜Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

2.1.7 XRD分析結果

圖6 孔石莼多糖及其鋅絡合物的XRD圖Fig. 6 X-ray diffraction patterns of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

從圖6中可看出，孔石莼多糖及其鋅絡合物均只在20°左右存在一不明顯的包峰，且多糖鋅的包峰強度高于原多糖的，但并未發(fā)現硫酸鋅的特征衍射峰，提示二者均為無定形結構，同時再次證明孔石莼多糖與Zn2+確實發(fā)生了絡合作用，推測Zn2+可能均勻地分散在孔石莼多糖的糖鏈上，生成絡合物。

2.1.8 SEM觀察結果

從圖7a1、b1中可發(fā)現孔石莼多糖與其鋅絡合物均呈層疊堆積的片狀，表面較為平整，但兩者的形貌均無規(guī)整性，參考相關文獻的研究結果，推測該現象可能是由于分子鏈之間互相交聯聚集形成的[33-34]，提示兩樣品的分子間均存在很強的相互作用，且均呈無定形結構，與XRD分析中得到的結果相符；此外，兩者均含多孔的蜂巢狀結構，這可能是凍干過程中冰晶升華而形成。通過對比圖7a2與b2，可發(fā)現孔石莼多糖表面較為光滑、緊密，而其鋅絡合物則較為粗糙，存在許多龜裂，兩者表面均存在一些較小的碎屑狀顆粒，但孔石莼多糖鋅表面的顆粒物明顯多于孔石莼多糖，由此亦可推斷，孔石莼多糖除了與Zn2+之間發(fā)生絡合反應外，還可能存在物理吸附現象。

圖7 孔石莼多糖（a）及其鋅絡合物（b）在不同放大倍數下的SEM圖Fig. 7 SEM images of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)

2.1.9 AFM分析結果

圖8 孔石莼多糖（a）及其鋅絡合物（b）在AFM下的照片Fig. 8 Atomic force microscopic images of Ulva pertusa polysaccharides (a)and polysaccharides-zinc complex (b)

由圖8可知，孔石莼多糖及其鋅絡合物分子鏈的大小、形狀均不均等，呈山峰狀、鏈狀顆粒，兩樣品的分子鏈寬度在幾十至幾百納米不等，明顯大于天然多糖分子鏈的寬度（0.1～1 nm），證明兩樣品的分子均是由多股糖鏈互相交聯纏結形成的聚集體，該現象與Wang Kaiping等[35]的研究結果相似；對比兩者的譜圖還可看出，孔石莼多糖分子聚集體整體分布相對較為均勻，高度約為1～2 nm左右，體積較??；而孔石莼多糖鋅分子聚集體明顯較原多糖的大，且整體分布參差不齊，聚集體高度分布在2～7 nm范圍，體積較大，此現象與黃靖等[23]在觀察肉蓯蓉多糖鋅絡合物時得到的相似，提示經過絡合改性，孔石莼多糖分子的團聚性增強。

2.2 孔石莼多糖及其鋅絡合物的體外降血糖活性

2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力測定結果

圖9 孔石莼多糖及其鋅絡合物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig. 9 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-glucosidase

如圖9所示，孔石莼多糖及其鋅絡合物樣液均在質量濃度大于5 mg/mL時才體現對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，且兩者的抑制率均隨質量濃度的增加而極顯著增大（P＜0.01）。相同質量濃度下，孔石莼多糖鋅的抑制率顯著或極顯著大于原多糖（P＜0.05或P＜0.01）。當質量濃度為25 mg/mL時，孔石莼多糖及其鋅絡合物樣液對α-葡萄糖苷酶抑制率均達到最大值，分別為（26.64±0.95）%、（54.66±1.20）%。經計算，兩者抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為42.87、23.63 mg/mL；IC50越小，抑制能力越強，可知同條件下，孔石莼多糖鋅樣液對α-葡萄糖苷酶的抑制能力是孔石莼多糖樣液的1.81 倍。

2.2.2 α-淀粉酶抑制能力測定結果

圖10 孔石莼多糖及其鋅絡合物對α-淀粉酶的抑制效果Fig. 10 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-amylase

從圖10中可以看出，相同質量濃度下，孔石莼多糖鋅的抑制率極顯著大于原多糖（P＜0.01）?？资欢嗵羌捌滗\絡合物樣液對α-淀粉酶的抑制率均在質量濃度為25 mg/mL時達到最大值，分別為（46.34±1.20）%、（76.94±0.73）%。經計算，兩者抑制α-淀粉酶的IC50分別為27.22、10.66 mg/mL，可知同條件下，孔石莼多糖鋅樣液對α-淀粉酶的抑制能力達到孔石莼多糖樣液的2.55 倍。

3 結 論

本研究以實驗室自制的孔石莼多糖為試材，制備孔石莼多糖鋅絡合物，采用GS-MS、GPC-MALLS-RI、剛果紅實驗、紫外-可見光譜、傅里葉變換紅外光譜、XRD、SEM、AFM等對孔石莼多糖及其鋅絡合物進行結構表征，并通過α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制實驗比較兩者的體外降血糖活性，探究絡合鋅改性對孔石莼多糖結構與重要生物活性的影響，主要結論如下：1）孔石莼多糖是由鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成的雜多糖，其中各單糖基的物質的量比為1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07；經過絡合鋅反應，產物中孔石莼多糖的總糖質量分數有原來的53.35%下降至49.40%。2）GPC-MALLS-RI分析結果顯示，孔石莼多糖鋅的分子質量、分子尺寸較原多糖明顯減小，但分子質量分布范圍明顯變寬，兩者的構象均為高支化度結構；剛果紅實驗結果顯示，經過絡合鋅改性，產物中孔石莼多糖的三螺旋結構基本消失。3）結合紫外-可見光譜與紅外光譜檢測結果推測，孔石莼多糖中的—COO－、—CH3、—OSO3－等基團與Zn2+發(fā)生了反應；XRD檢測結果表明，孔石莼多糖及其鋅絡合物均為無定形結構，且Zn2+高度分散在后者的糖鏈上。4）SEM觀察結果提示，孔石莼多糖及其鋅絡合物的表面形貌產生明顯差異，孔石莼多糖與Zn2+除了發(fā)生絡合反應外，還可能存在物理吸附現象；AFM結果顯示，孔石莼多糖鋅的分子形貌較原多糖的發(fā)生了明顯變化，其分子團聚性顯著增強，分子聚集體尺寸明顯增大，且整體分布差別變大。5）孔石莼多糖及其鋅絡合物在實驗的質量濃度范圍內均具有一定的體外降血糖活性，且存在量效關系；相同質量濃度下，孔石莼多糖鋅對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制率均顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）高于孔石莼多糖，前者的抑制能力分別是后者的1.81、2.55 倍。推測可能是經過絡合反應，孔石莼多糖的活性基團與Zn2+產生了協同作用，從而增強了其體外降血糖活性。此外，在絡合過程中多糖發(fā)生了部分降解，使得更多的活性基團得到暴露，亦可能是孔石莼多糖鋅體外降血糖活性強于原多糖的原因之一。

綜上，絡合鋅改性使孔石莼多糖鋅的分子結構特征較原多糖發(fā)生明顯改變，體外降血糖活性顯著增強，其作為一種新型的多糖補鋅劑，具有廣闊的開發(fā)前景。