屈平平

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院山東濰坊 261061）

夏季高溫是導(dǎo)致奶牛等哺乳動(dòng)物不孕和妊娠失敗的主要原因，母牛在妊娠早期遭受熱應(yīng)激后，胚胎的死亡率和畸形率也明顯增加[1-3]。驢為季節(jié)多次發(fā)情動(dòng)物，7～9月份是德州母驢發(fā)情旺季，此時(shí)正值夏季高溫，不利于胚胎的著床和發(fā)育，易導(dǎo)致妊娠失?。幻磕?～9月份，西藏野驢也進(jìn)入繁殖交配期，如果西藏野驢引種至中原，也將面臨熱應(yīng)激對(duì)其繁殖力的影響。本項(xiàng)目以小白鼠為動(dòng)物模型，研究熱應(yīng)激對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的影響。試驗(yàn)通過對(duì)小鼠早期囊胚進(jìn)行不同程度的熱應(yīng)激處理，觀察熱應(yīng)激對(duì)小鼠早期囊胚的后續(xù)發(fā)育力的影響，為探索熱應(yīng)激抑制奶牛等哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的機(jī)理提供一定的依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為昆明種（KM）8～9周齡性成熟小白鼠，體重25±0.5g，購(gòu)買于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼喂顆粒飼料，自由飲水，并進(jìn)行光照控制（6:00-18:00光照，18:00-6:00黑暗）；溫度控制在18～25℃。適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，用于超數(shù)排卵。

1.2 試驗(yàn)藥品

NaCl，KCl，NaHCO3，KH2PO4，MgSO4，CaCl2，EDTA，HEPES，BSA，谷氨酰胺，乳酸鈉，丙酮酸鈉，青霉素，硫酸鏈霉素，瓊脂糖，地衣紅（均購(gòu)自Sigma公司）；PMSG和HCG購(gòu)自寧波三生藥業(yè)；檸檬酸鈉，甲醇，乙酸，0.01MPBS等。

1.3 試驗(yàn)器材

體視顯微鏡（SZX-12，日本OLYMPUS公司），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），CO2培養(yǎng)箱（Galaxy B，德國(guó)MMM公司），CO2培養(yǎng)箱（Steri-Cycle，美國(guó)Forma公司），透明加熱板（p w-1，日本富士平公司），熒光顯微鏡（SZX-14，日本OLYMPUS公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 小鼠胚胎體外培養(yǎng)

2.1.1 小鼠超數(shù)排卵將性成熟、生長(zhǎng)健康的雌性昆明小鼠于16：00腹腔內(nèi)注射PMSG（10IU/只），48h后腹腔注射HCG（10IU/只），雌鼠注射HCG后立即與成熟雄鼠1∶1合籠。次日早晨檢查陰道栓，有陰栓者備用。

2.1.2 小鼠受精卵收集及體外培養(yǎng)在檢出陰道栓的當(dāng)天19:00左右，用頸椎脫臼法處死雌鼠，取出輸卵管和部分子宮角，在體式顯微鏡下，將形態(tài)完好的受精卵在Hepes-CZB中沖洗5次后，轉(zhuǎn)移至50μL預(yù)平衡6～12h的CZB培養(yǎng)液微滴中，每個(gè)液滴放置30枚胚胎，置于37℃、5%CO2、100%RH的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)胚胎發(fā)育至4-細(xì)胞期時(shí)，將胚胎轉(zhuǎn)移至葡萄糖-CZB培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，直至發(fā)育至早期囊胚（圖1），用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 熱應(yīng)激處理

將早期囊胚分別在39℃，5.5%CO2條件下和41℃，6%CO2條件下熱應(yīng)激處理2h。熱應(yīng)激結(jié)束后，將胚胎在37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)照組胚胎在37℃，5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)。

2.3 熱應(yīng)激后小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的比例

分別在熱應(yīng)激結(jié)束后24h時(shí)，在體式鏡下觀察熱應(yīng)激早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的比率（圖2）。試驗(yàn)重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)的胚胎數(shù)為45～50枚。

圖1 發(fā)育至早期囊胚的小鼠胚胎

圖2 發(fā)育至擴(kuò)張囊胚的小鼠胚胎

2.4 熱應(yīng)激后小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的平均總細(xì)胞數(shù)

分別將熱應(yīng)激后24h收集的擴(kuò)張囊胚，置于1%和0.5%低滲檸檬酸鈉溶液中處理30min和20min，再移到3∶1（V/V）的甲醇-冰醋酸固定液中處理30min。而后將胚胎移至APES（3-aminopropyl-triethoxy silane）硅化的載玻片上，干燥后，滴加0.5mL1%醋酸地衣紅染色液，室溫下染色15～20min；水洗后，稍干燥，封片，鏡檢。記錄每枚胚胎的總細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)30～40枚胚胎。

3 結(jié)果

3.1 熱應(yīng)激對(duì)小鼠早期囊胚育到擴(kuò)張囊胚比率的影響

正常培養(yǎng)組（37℃連續(xù)培養(yǎng)）、溫和熱應(yīng)激組（39℃2h培養(yǎng)）、強(qiáng)烈熱應(yīng)激組（41℃2h培養(yǎng)）早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚率分別為81.7±6.5%，80.8±6.4%和63.3±3.6%；與正常培養(yǎng)組相比，溫和熱應(yīng)激組早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的比率差異不顯著。但是，強(qiáng)烈熱應(yīng)激后小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的比率降低了22.5%，與正常培養(yǎng)組和溫和熱應(yīng)激組差異顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果表明強(qiáng)烈熱應(yīng)激顯著降低體外小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的能力。

表1 熱應(yīng)激對(duì)小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚比率的影響

3.2 熱應(yīng)激對(duì)小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

正常培養(yǎng)組、溫和熱應(yīng)激組和強(qiáng)烈熱應(yīng)激組小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的平均總細(xì)胞數(shù)分別為57.11±1.7、49.89±1.3和42.22±2.0。與正常培養(yǎng)組相比，溫和熱應(yīng)激組和強(qiáng)烈熱應(yīng)激組早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的平均總細(xì)胞數(shù)分別減少了8個(gè)和15個(gè)，與對(duì)照組均差異顯著（P＜0.05），以上結(jié)果表明熱應(yīng)激能抑制小鼠早期囊胚的細(xì)胞分裂，這可能是熱應(yīng)激造成部分胚胎死亡的原因之一。

表2 熱應(yīng)激對(duì)小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚總細(xì)胞數(shù)的影響

4 討論

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)在合子形成期間對(duì)母鼠進(jìn)行35℃12h熱應(yīng)激，受精卵發(fā)育到桑椹胚和囊胚的比率明顯降低；41℃1～2h熱應(yīng)激就能降低體外2-細(xì)胞期胚胎的囊胚形成率。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)43℃2h強(qiáng)烈熱應(yīng)激顯著降低了體外桑椹胚的存活率和囊胚形成率。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，39℃2h的溫和熱應(yīng)激對(duì)小鼠早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚的比率幾乎沒有影響，但是41℃2h的強(qiáng)烈熱應(yīng)激能顯著降低早期囊胚發(fā)育到擴(kuò)張囊胚比率，說明小鼠早期囊胚不能耐受短時(shí)間的強(qiáng)烈熱應(yīng)激。