郭 都,張文婷,郝旭昇,尹術(shù)華,郭 曉,鄭楊洋,于海波,石 超
(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100)
副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一種無(wú)芽孢、無(wú)莢膜、有鞭毛、能運(yùn)動(dòng)的短桿或弧桿狀的革蘭氏陰性細(xì)菌,屬于弧菌科弧菌屬[1]。 副溶血性弧菌是一種嗜鹽菌,可在含鹽量為0.5%~8%的環(huán)境中正常生長(zhǎng)[2],廣泛分布于近岸海水、海底沉積物和海產(chǎn)品中[3],其在海產(chǎn)品中的檢出率夏季(7~9 月份)可高達(dá)50%以上[4],其中蝦類、魚(yú)類和貝類受副溶血性弧菌污染尤其嚴(yán)重[5]。
近年來(lái),隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高,海鮮食品逐漸進(jìn)入內(nèi)陸,產(chǎn)銷量逐年增加,由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件也呈逐年上升趨勢(shì)[6]。 副溶血性弧菌引起的食源性疾病一般為急發(fā)病,潛伏期2~24 h。 人體感染副溶血性弧菌后,輕者會(huì)出現(xiàn)以惡心、嘔吐或腹痛為主要癥狀的急性腸胃炎[7],重者可能會(huì)脫水、休克、昏迷甚至死亡[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì),在東南亞國(guó)家,約50%的腸胃炎是由副溶血性弧菌引起的;在美國(guó)、歐洲地區(qū),副溶血性弧菌也是危害公眾健康的主要致病菌之一,其感染發(fā)生率逐年增加[9];在中國(guó),由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在數(shù)量上已超過(guò)沙門氏菌中毒案例(2012年報(bào)道),副溶血性弧菌已成為首要的食源性致病菌[10]。由此可見(jiàn),副溶血性弧菌引起的食物污染在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害著公眾的健康安全。
為降低海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的污染風(fēng)險(xiǎn),目前應(yīng)用的控制措施主要包括輻照保鮮、 氣調(diào)保鮮、化學(xué)防腐劑保鮮以及生物保鮮等技術(shù)[11-13]。 輻照保鮮和氣調(diào)保鮮雖然能夠很大程度地保留食品的營(yíng)養(yǎng)和香味,但其缺點(diǎn)在于對(duì)技術(shù)及工廠方面安全防護(hù)措施的要求高,實(shí)際應(yīng)用成本也較高[14-15];化學(xué)防腐劑雖然有良好的抑菌效果,但易使菌體產(chǎn)生耐受性,而且有可能改變食品的自然風(fēng)味和質(zhì)構(gòu),往往具有潛在毒性,不被消費(fèi)者接受[16]。 因此尋求安全、有效的控制海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的方法具有重要意義。 近年來(lái),植物源活性物質(zhì)因具有天然、安全和營(yíng)養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[17],越來(lái)越多的研究者將目光投向天然植物源活性物質(zhì)抑制食源性致病菌[14,18]。
肉桂醛是肉桂精油的主要活性成分,主要存在于肉桂樹(shù)皮,它在自然界中的天然存在形式為反式肉桂醛(C9H8O,trans-cinnamaldehyde,TC)[19]。 反式肉桂醛已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration,F(xiàn)DA) 列為公認(rèn)安全的食品成分(Generally Recognized as Safe,GRAS)。 反式肉桂醛作為一種食品添加劑,已被應(yīng)用于多種食品中,如口香糖、冰淇淋、糖果和飲料等,它還可以與山毛櫸堅(jiān)果殼粉混合成商品化的肉桂粉,用于面包、蛋糕及其他烘焙產(chǎn)品[20]。 據(jù)報(bào)道,反式肉桂醛具有抗癌、抗炎和治療糖尿病等多種生理功能[21],并且其已被證實(shí)對(duì)多種致病菌如金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7 和沙門氏菌具有良好的抑制作用[22-24],但目前反式肉桂醛對(duì)海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的抑制作用及抑菌機(jī)理卻尚未研究。
因此,作者以副溶血性弧菌為檢測(cè)對(duì)象,首先通過(guò)測(cè)定反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的最小抑菌濃度,評(píng)價(jià)其抑菌效果;其次通過(guò)測(cè)定反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌生長(zhǎng)曲線、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)、細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞形態(tài)的影響,探究其抑菌機(jī)理;最后通過(guò)構(gòu)建副溶血性弧菌污染的鮮蝦模型,評(píng)價(jià)反式肉桂醛對(duì)鮮蝦中副溶血性弧菌的控制作用,旨在為反式肉桂醛作為一種植物源抑菌劑用于控制海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的污染提供理論依據(jù)。
副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802、ATCC 33847:購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American type culture collection,ATCC);副溶血性弧菌分離菌株 241、245、247、249:由香港理工大學(xué)食物安全及科技研究中心分離自鮮蝦。
NaCl 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基:胰蛋白胨15 g、植物蛋白胨 5 g、氯化鈉 30 g、瓊脂 15 g,加蒸餾水定容至1 L,加熱煮沸至完全溶解后,121 ℃高壓滅菌15 min 備用;3 g/dL NaCl 胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(3 g/dL NaCl Tryptone Soya Broth,3 g/dL NaCl TSB):胰蛋白胨17 g、植物蛋白胨3 g、氯化鈉30 g、磷酸氫二鉀2.5 g、葡萄糖2.5 g,加蒸餾水定容至1 L,加熱煮沸至完全溶解后,121 ℃高壓滅菌15 min備用。
反式肉桂 醛 (trans-cinnamaldehyde,HPLC ≥99%):購(gòu)于美國(guó) Sigma 試劑公司;LIVE/DEAD?BacLightTM細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒:購(gòu)于賽默飛世爾科技公司;二甲基亞砜(DMSO,HPLC≥99.5%):購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)所用其他試劑:均為國(guó)產(chǎn)分析純。
鮮蝦:購(gòu)于陜西省咸陽(yáng)市楊凌示范區(qū)盛世陽(yáng)光超市,鮮活低溫條件運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,平均體長(zhǎng)(7.0±0.5)cm,平均體重(4.44±0.25) g。
微生物全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀:芬蘭Bioscreen公司產(chǎn)品;低溫冷凍離心機(jī)5804R:德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;多功能微孔板檢測(cè)儀Microplate Readers Spectra Max M 2:美國(guó)Molecular Devices 公司產(chǎn)品;激光共聚焦顯微鏡Nikon A1:日本Nikon 公司產(chǎn)品;場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡S-4800:日本Hitachi 公司產(chǎn)品。
1.3.1 菌株活化與菌懸液制備 將-80 ℃保存的副溶血性弧菌菌株(ATCC 17802、ATCC 33847、分離菌 241、245、247、249) 劃線于 3 g/dL NaCl TSA 培養(yǎng)基,經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后,分別挑取單菌落接種于3 g/dL NaCl TSB 肉湯,置于 37 ℃恒溫?fù)u床(120 r/min)培養(yǎng) 12 h。 隨后,將菌懸液離心(4 ℃ 8 000 g,離心10 min),使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate Buffer Solution,PBS,pH 7.2)清洗菌體兩次,離心參數(shù)設(shè)置同前。 隨后使用PBS 溶液調(diào)整菌懸液600 nm處吸光度值(OD600nm)為0.5(菌懸液濃度約108CFU/mL)備用。
1.3.2 反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌最小抑菌濃度的測(cè)定 試驗(yàn)參照 Yousef 等(2013)[25]的方法,略有修改。 在 24 孔板的第一個(gè)孔中加入 1 mL、45~55 ℃經(jīng)高溫高壓滅菌的3 g/dL NaCl TSA 培養(yǎng)基,將反式肉桂醛加入至第一個(gè)孔,充分吹打混勻,使其質(zhì)量濃度為 200 μg/mL。 隨后使用 3 g/dL NaCl 的 TSA 在24 孔板中逐步稀釋,使反式肉桂醛終質(zhì)量濃度分別為 140、100、70、50、35 和 25 μg/mL (每孔終體積為0.5 mL,DMSO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%)。 以不添加反式肉桂醛的3 g/dL NaCl TSA 培養(yǎng)基 (含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%DMSO)為陰性對(duì)照組,以添加卡那霉素(0.1 mg/mL)的3 g/dL NaCl TSA 培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照組。待瓊脂冷卻凝固后,分別取1.3.1 中制備的菌懸液2 μL 接種至24 孔板各孔中央,將樣品置于37 ℃培養(yǎng)箱,24 h后觀察。試驗(yàn)將經(jīng)過(guò)24 h 培養(yǎng)后肉眼觀察無(wú)明顯菌落生長(zhǎng)的最低反式肉桂醛質(zhì)量濃度作為最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)。
1.3.3 反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌生長(zhǎng)曲線的影響 試驗(yàn)選取副溶血型弧菌ATCC 17802 進(jìn)行后續(xù)研究。 參照 Silvaangulo 等(2014)[26]的方法,將 1.3.1中制備的副溶血性弧菌ATCC 17802 菌懸液離心 (4 ℃8 000 g,離心 10 min),使用無(wú)菌 3 g/dL NaCl TSB肉湯將菌體清洗兩次。 隨后使用3 g/dL NaCl TSB調(diào)整菌液OD600nm=0.5,并使用3 g/dL NaCl TSB 肉湯將菌液稀釋100 倍(約106CFU/mL)。在蜂窩板每孔中加入 125 μL 菌懸液。 隨后,向蜂窩板每孔加入125 μL 使用3 g/dL NaCl TSB 肉湯溶解的反式肉桂醛溶液,使反式肉桂醛終質(zhì)量濃度分別為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC。 試驗(yàn)設(shè)置不含反式肉桂醛的菌懸液(含0.5% DMSO)作為對(duì)照組,同時(shí)設(shè)置3 g/dL NaCl TSB 肉湯 (含0.5%DMSO)作為背景空白對(duì)照組,每組設(shè)置6 個(gè)平行。將樣品置于Bioscreen 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀,于37 ℃下每隔1 小時(shí)測(cè)定24 h 內(nèi)各孔吸光度值,繪制生長(zhǎng)曲線。
選取修正Gompertz 模型擬合菌株生長(zhǎng)狀況,并表征其生長(zhǎng)參數(shù)。 修正Gompertz 模型的表達(dá)式為:
其中,At表示在 t 時(shí)的菌液濃度;t 表示培養(yǎng)時(shí)間(h);A 表示初始菌液濃度;B 表示最大的菌液濃度;μ 為指數(shù)期的相對(duì)生長(zhǎng)速率;λ 為遲滯期 (h);M 為菌株達(dá)到指數(shù)期所用的時(shí)間(h);μmax為最大生長(zhǎng)速率。 采用SPSS 20.0 軟件中的非線性回歸方法擬合A、B、μ、λ、M 和 μmax參數(shù)值。
1.3.4 反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌細(xì)胞膜完整性影響的測(cè)定 反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌細(xì)胞膜完整性影響的測(cè)定參照Alakomi 等(2005)[27]所采用的LIVE/DEAD?細(xì)菌活性檢測(cè)試劑盒方法。試劑盒中含有SYTO 9 和碘化丙啶 (PI) 兩種核酸染料,SYTO 9 是小分子染料,能夠進(jìn)入細(xì)胞膜完整或細(xì)胞膜損傷菌并與其DNA 或RNA 結(jié)合從而發(fā)出綠色熒光[28]。PI 是大分子染料,它只能夠進(jìn)入細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞中并與其核酸結(jié)合從而使菌體染色為紅色并覆蓋SYTO 9 的綠色熒光[29],因此紅色熒光強(qiáng)度比例代表細(xì)胞膜損傷菌所占比例。試驗(yàn)使用0.85 g/dL NaCl 將1.3.1 中離心收集的菌體洗滌2 次,隨后加入2 mL 0.85 g/dL NaCl 使菌體重懸浮。 為獲得細(xì)胞膜完整菌和細(xì)胞膜損傷菌,分別取1 mL 上述重懸菌液于 20 mL 0.85 g/dL NaCl 溶液(活菌組)和 20 mL 體積分?jǐn)?shù)70%異丙醇溶液(死菌組)中,于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h(每15 分鐘搖勻一次)。隨后使用0.85 g/dL NaCl 溶液洗滌菌體并重新懸浮,調(diào)整菌懸液OD600nm=0.5(兩組誤差不超過(guò)0.01)。 將死菌組細(xì)胞與活菌組細(xì)胞混合,使死細(xì)胞比例分別為0%、10%、50%、90%和100%作為標(biāo)曲組。
在活菌組菌懸液中添加反式肉桂醛,使其終質(zhì)量濃度分別為 0、MIC 和 2MIC。 將樣品在 37 ℃培養(yǎng)30 min 后離心(4 ℃、11 000 g,離心 1 min),隨后使用0.85 g/dL NaCl 溶液重懸浮菌體。各取樣品組、標(biāo)曲組100 μL 加入到黑色96 孔酶標(biāo)板中,每組 3 個(gè)平行。 將紅色熒光染料 PI (2×)、 綠色熒光染料SYTO 9(2×)和無(wú)菌水以體積比 3∶3∶1 000 混合,在黑色96 孔酶標(biāo)板各孔中加入100 μL 混合染料,充分吹打混勻。 將96 孔酶標(biāo)板置于25 ℃培養(yǎng)箱避光孵育15 min,隨后使用多功能微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)各孔熒光強(qiáng)度值。 SYTO 9 染料的激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為485/542,PI 染料的激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為485/610。通過(guò)測(cè)定紅色熒光強(qiáng)度,構(gòu)建細(xì)胞膜不完整細(xì)菌與其對(duì)應(yīng)的紅色熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后測(cè)定樣品組紅色熒光強(qiáng)度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞膜不完整細(xì)菌百分比。
1.3.5 反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌細(xì)胞膜完整性影響的觀察 參照 Gu 等(2012)[30]的方法,將 1.3.4中不同濃度反式肉桂醛(0、MIC 和2MIC)與活菌組菌懸液作用 30 min 后的菌體離心 (4 ℃、10 000 g,離心2 min),隨后使用0.85 g/dL NaCl 溶液將菌體重懸浮。 將紅色熒光染料PI(2×)與綠色熒光染料SYTO 9(2×)等體積混合,在上述菌懸液中分別加入3 μL 混合染料并輕柔混勻,避光孵育15 min。隨后,將樣品滴加于載玻片,蓋上蓋玻片,使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察菌體熒光染色情況。
1.3.6 反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響 為測(cè)定反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響,按照1.3.1 中的方法制備菌懸液。 將添加不同質(zhì)量濃度反式肉桂醛(0、MIC 和2MIC)的菌懸液置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),分別在2 h 和4 h 取出,使用 PBS 溶液洗滌菌體兩次。 參照 Lv 等(2011)[31]的方法,將上述洗滌后的菌體經(jīng)體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液4 ℃固定過(guò)夜后,使用PBS 溶液和無(wú)菌水依次漂洗,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸溶液中固定5 h(4 ℃)后,分別使用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%和90%乙醇脫水10min,最后使用100%乙醇脫水。 將樣品滴加至專用玻片后干燥,將玻片有序貼附于載物臺(tái)抽真空干燥后噴金,使用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.3.7 反式肉桂醛對(duì)鮮蝦中副溶血型弧菌的抑制作用 使用PBS 溶液將1.3.1 中制備的副溶血型弧菌ATCC 17802、 分離菌241 和分離菌245 菌懸液分別稀釋至約106CFU/mL,隨后將3 種菌懸液等體積混合備用。 參照孫亞軍等(2014)[32]的方法處理鮮蝦。 在無(wú)菌條件下,將鮮蝦在無(wú)菌水中清洗1 次,隨后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2% NaClO 消毒液中浸泡5 min,將鮮蝦在無(wú)菌水中再清洗2 次以除去殘留的NaClO。將反式肉桂醛添加至3 種菌懸液的混合菌液,使反式肉桂醛終濃度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0%、0.1%、0.2%和0.4%,同時(shí)將鮮蝦樣品放入其中均勻混合。 隨后將鮮蝦取出置于無(wú)菌培養(yǎng)皿瀝干3 min 后,轉(zhuǎn)移至4 °C冰箱。分別在 0、1、2、4、6、8 h 取出鮮蝦樣品,置于含有30 mL PBS 溶液的離心管中渦旋,使鮮蝦上的菌體充分脫落。 吸取渦旋后的上清液,使用PBS 不稀釋或進(jìn)行10 倍稀釋后涂布于3 g/dL NaCl TSA 培養(yǎng)基。 37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后,記錄細(xì)菌總數(shù),每組設(shè)置3 個(gè)平行。
數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS 軟件(version 20.0,Inc.,Chicago,IL) 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著性檢驗(yàn)采用單因子方差分析,P<0.05 為差異顯著(*),P<0.01 為差異極顯著(**)。
反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的MIC 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明:反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC 17802 和 ATCC 33847 的 MIC 分別為50 μg/mL 和 70 μg/mL。 可見(jiàn),反式肉桂醛對(duì)ATCC 17802 的抑制效果強(qiáng)于ATCC 33847。反式肉桂醛對(duì)分離自鮮蝦的副溶血性弧菌菌株241、245、247 和249 的 MIC 一致,均為 70 μg/mL。 部分學(xué)者也探究了其他植物源活性物質(zhì)對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用:Direkbusarakom 等(1998)[33]研究發(fā)現(xiàn)番石榴與苦瓜素對(duì)副溶血性弧菌的MIC 分別為0.625 mg/mL和1.250 mg/mL;Packiavathy 等(2013)[34]測(cè)定了姜黃素對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802 的MIC 為0.15 mg/mL;賀怡瓊等(2016)[35]的研究表明,酸漿根莖葉提取物對(duì)副溶血性弧菌的MIC 為50 mg/mL。 通過(guò)比較已研究的植物源活性物質(zhì)對(duì)副溶血性弧菌的最小抑菌濃度,可以得出,反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌具有良好的抑制作用。
表1 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of transcinnamaldehyde against different strains of Vibrio parahaemolyticus
反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802 生長(zhǎng)曲線的影響見(jiàn)圖1。由圖1 可知,未經(jīng)反式肉桂醛處理的副溶血性弧菌 (對(duì)照組)5 h 后生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定,開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期。 當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為MIC時(shí),副溶血性弧菌的生長(zhǎng)完全受到了抑制。 質(zhì)量濃度為1/2MIC 的反式肉桂醛雖沒(méi)有完全抑制副溶血性弧菌的生長(zhǎng),但與對(duì)照組相比,副溶血性弧菌生長(zhǎng)延滯期增長(zhǎng),培養(yǎng)約7 h 后才開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)期。1/8MIC、1/16MIC 和1/32MIC 反式肉桂醛組副溶血性弧菌的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。
本研究結(jié)果表明:經(jīng)瓊脂稀釋法測(cè)定得到的最小抑菌質(zhì)量濃度的反式肉桂醛(50 μg/mL),在肉湯中也能夠抑制副溶血性弧菌ATCC 17802 的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)反映了微生物生長(zhǎng)各個(gè)階段的菌體數(shù)量,本研究使用液體稀釋法通過(guò)測(cè)定菌懸液光密度值(OD600nm)間接反映菌體數(shù)量,也有研究采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌在不同時(shí)間的菌落數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線,如 Hermans 等(2011)[36]采用平板計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)反式肉桂醛對(duì)空腸彎曲菌具有呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制效果。 兩種方法均能反應(yīng)微生物的生長(zhǎng)規(guī)律,但與本試驗(yàn)采用的比濁法相比,平板計(jì)數(shù)法雖能直接反映細(xì)菌數(shù)量,但實(shí)驗(yàn)誤差較大且費(fèi)時(shí)不方便。
圖1 不同反式肉桂醛濃度作用下副溶血性弧菌ATCC 17802 在含3 g/dL NaCl TSB 肉湯中的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves for Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 in 3 g/dL NaCl TSB with various concentrations of trans-cinnamaldehyde
試驗(yàn)通過(guò)擬合Gompertz 模型表征不同質(zhì)量濃度反式肉桂醛作用后的副溶血性弧菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù),各擬合方程的 R2均大于 0.98,表明修正Gompertz 模型能夠較好地?cái)M合菌株的生長(zhǎng)狀況。 如表2 所示,與對(duì)照組相比,經(jīng)各質(zhì)量濃度反式肉桂醛處理后,副溶血性弧菌的生長(zhǎng)延滯期(λ)均增加,質(zhì)量濃度為1/2MIC 的反式肉桂醛使λ 由對(duì)照組的1.756 h 增加至7.420 h。 此外,不同質(zhì)量濃度的反式肉桂醛使副溶血性弧菌最大生長(zhǎng)速率(μmax)顯著減小,最大光密度值(ODmax)顯著降低,并呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。
首先構(gòu)建了不同比例的副溶血性弧菌細(xì)胞膜損傷菌與其對(duì)應(yīng)的紅色熒光強(qiáng)度值之間的線性關(guān)系作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=143.88x+298.03),結(jié)果顯示線性良好(R2=0.99)。在此基礎(chǔ)上研究了反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。未經(jīng)反式肉桂醛處理的(對(duì)照組)副溶血性弧菌紅色熒光強(qiáng)度值為300.05±1.05,細(xì)胞膜不完整細(xì)菌比例為1.4%。 與對(duì)照組相比,當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為MIC 時(shí),副溶血性弧菌紅色熒光強(qiáng)度值顯著增加,細(xì)胞膜損傷菌比例增加至8.3%(P<0.05)。質(zhì)量濃度為2MIC 的反式肉桂醛使副溶血性弧菌細(xì)胞膜損傷菌比例增加至29.9%(P<0.01)。由此得出,反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性有顯著性降低作用,且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。
表2 不同反式肉桂醛質(zhì)量濃度作用下副溶血性弧菌ATCC 17802 的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Growth kinetic parameters of Vibrio parahemolyticus ATCC 17802 with different concentrations of trans-cinnamaldehyde
細(xì)胞膜的完整性是菌體正常生長(zhǎng)代謝的重要條件。 細(xì)胞膜完整性被破壞后,可能會(huì)導(dǎo)致一些重要細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)、核酸和糖類物質(zhì)流出,從而影響菌體的正常生長(zhǎng)代謝[37]。 作者通過(guò)測(cè)定LIVE/DEAD?試劑盒中所含的兩種染料 (SYTO 9 和PI)與細(xì)胞膜完整及不完整菌體核酸結(jié)合后所產(chǎn)生的特異性熒光來(lái)分析反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌細(xì)胞膜完整性的影響。 還有一些方法也可用于測(cè)定細(xì)胞膜完整性:Diao 等(2014)[18]通過(guò)測(cè)定菌懸液 260 nm 處吸光度值 (胞內(nèi)流出的核酸及蛋白質(zhì)在260~280 nm 有較大吸收峰)評(píng)價(jià)不同濃度的茴香精油對(duì)志賀氏菌細(xì)胞膜完整性的破壞作用,得出質(zhì)量濃度為2MIC 的茴香精油使志賀氏菌OD260nm值增加了16.64 倍。Zhou 等(2005)[38]測(cè)定了含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.125%殼寡聚糖的變形鏈球菌培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶及γ 谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量,結(jié)果菌液上清液中的這兩種胞內(nèi)酶含量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),表明殼寡聚糖使細(xì)菌明顯出現(xiàn)了胞內(nèi)酶溢出的現(xiàn)象,以此評(píng)價(jià)殼寡聚糖對(duì)變形鏈球菌細(xì)胞膜完整性的破壞作用。Shi 等(2016)[39]也采用 LIVE/DEAD?試劑盒方法測(cè)定了檸檬醛對(duì)阪崎腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響,通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞膜完整菌比例與其對(duì)應(yīng)的綠色熒光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系,測(cè)定了經(jīng)檸檬醛處理后的阪崎腸桿菌細(xì)胞膜完整菌所占比例。 結(jié)果表明,質(zhì)量濃度為2MIC 的檸檬醛使阪崎腸桿菌細(xì)胞膜完整菌的比例顯著降低了85%(P<0.05)。
圖2 反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌ATCC 17802 細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 2 Effect of trans-cinnamaldehyde on the membrane integrality of Vibrio parahemolyticus ATCC 17802
試驗(yàn)利用激光共聚焦成像結(jié)合熒光染色技術(shù)進(jìn)行反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性影響的觀察和分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。
由于PI 只能透過(guò)細(xì)胞膜損傷菌,所以,當(dāng)在共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈紅色時(shí),則意味著菌體細(xì)胞膜的完整性遭到了破壞。 由圖3 可知,未經(jīng)反式肉桂醛處理的(對(duì)照組)副溶血性弧菌幾乎全部被 SYTO 9 染為綠色(圖 3(a)),這說(shuō)明對(duì)照組細(xì)菌細(xì)胞膜完整。與對(duì)照組相比,經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC 的反式肉桂醛處理后,菌體呈現(xiàn)少量紅色熒光(圖3(b))。隨著反式肉桂醛質(zhì)量濃度增加至2MIC,約30%~40%的綠色熒光被紅色熒光覆蓋,呈現(xiàn)橘紅色的弧桿狀形態(tài)(圖3(c))。這表明反式肉桂醛能夠降低副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整菌的比例,并呈質(zhì)量濃度依賴性,這與2.3 的測(cè)定結(jié)果相吻合。
圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察未經(jīng)反式肉桂醛處理(a)、經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC 反式肉桂醛處理(b)及2MIC 反式肉桂醛處理(c)的副溶血性弧菌ATCC 17802 細(xì)胞膜完整性Fig. 3 Confocal laser scanning microscope analysis of Vibrio parahemolyticus ATCC 17802 untreated with trans-cinnamaldehyde,treated with transcinnamaldehyde at MIC and 2MIC
試驗(yàn)利用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察反式肉桂醛對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞形態(tài)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。未經(jīng)反式肉桂醛處理的副溶血性弧菌細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)弧形、桿狀、外觀飽滿、表面光滑(圖 4(a),圖 4(d))。 與對(duì)照組相比,質(zhì)量濃度為MIC 的反式肉桂醛作用2 h后,副溶血型弧菌菌體呈現(xiàn)輕度皺縮且中心凹陷(圖 4(b))。 當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度增加至 2MIC 且作用于副溶血性弧菌4 h 后,大部分菌體出現(xiàn)干癟皺縮(圖 4(f))。 以上結(jié)果表明,反式肉桂醛影響了副溶血型弧菌的細(xì)胞形態(tài)。
圖 4 未經(jīng)反式肉桂醛作用 2 h(a)、4 h(d),經(jīng)濃度為 MIC反式肉桂醛作用 2 h(b)、4 h(e),經(jīng)濃度為 2MIC 反式肉桂醛作用 2 h(c)、4 h(f)后副溶血性弧菌 ATCC 17802 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖Fig. 4 Field emission -scanning electron micrographs of Vibrio parahemolyticus ATCC 17802 untreated with trans-cinnamaldehyde for 2 h (a) and 4 h(d),treated with trans-cinnamaldehyde at MIC for 2 h (b) and 4 h (e),treated with transcinnamaldehyde at 2MIC for 2 h(c) and 4 h(f)
類似的,Liu 等 (2016)[40]通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),1.5MIC(MIC=0.625 mg/mL)和 5MIC 的二氫楊梅素(藤茶中的主要活性物質(zhì))使副溶血性弧菌菌體干癟、表面粗糙,當(dāng)質(zhì)量濃度增加為10MIC 時(shí),菌體出現(xiàn)破裂。藍(lán)蔚青等(2014)[41]發(fā)現(xiàn)經(jīng)殼聚糖、茶多酚和溶菌酶復(fù)合保鮮劑處理后,金黃色葡萄球菌菌體發(fā)生扭曲變形、干癟破裂的現(xiàn)象。張赟彬等(2015)[42]觀察了質(zhì)量濃度為MIC 的肉桂醛使金黃色葡萄球菌失去了圓滑的球狀形態(tài)、使大腸桿菌菌體細(xì)胞凹陷,胞膜表面褶皺,但未使菌體溶解破裂。
為探究反式肉桂醛的實(shí)際應(yīng)用效果,試驗(yàn)構(gòu)建了副溶血型弧菌污染的鮮蝦模型,并結(jié)合鮮蝦運(yùn)輸、銷售及家庭冷藏過(guò)程中的常用溫度考慮,探究了反式肉桂醛在4 ℃對(duì)鮮蝦中副溶血型弧菌的抑制效果,結(jié)果見(jiàn)圖5。 在0 h 時(shí),對(duì)照組及各質(zhì)量濃度反式肉桂醛處理組的鮮蝦中副溶血性弧菌細(xì)菌總數(shù)均為 5.7。 在 1 h 時(shí),0.1 mg/mL 和 0.2 mg/mL 反式肉桂醛使鮮蝦中的副溶血性弧菌細(xì)菌總數(shù)分別下降至4.8 和3.6,而質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的反式肉桂醛使細(xì)菌總數(shù)降低至檢出限以下。在8 h 時(shí),副溶血性弧菌細(xì)菌總數(shù)經(jīng)0.1 mg/mL 和0.2 mg/mL 反式肉桂醛處理后分別下降了2.2 和3.4。反式肉桂醛對(duì)鮮蝦中副溶血型弧菌的抑制作用隨反式肉桂醛質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。
圖5 反式肉桂醛在4 ℃對(duì)鮮蝦中副溶血型弧菌的抑菌作用Fig. 5 Inhibitory effects of trans -cinnamaldehyde on Vibrio parahaemolyticus in shrimp at 4 ℃
類似的研究表明,反式肉桂醛能夠降低多種食品中的食源性致病菌的數(shù)量。Amalaradjou 等(2009)[24]證明了0.5 mg/mL 反式肉桂醛在4 ℃對(duì)復(fù)原嬰幼兒牛乳中阪崎克羅諾腸桿菌具有良好的抑制效果,處理10 h 后細(xì)菌總數(shù)全部降低至檢出限以下。 研究表明,當(dāng)牛肉餡中大腸桿菌O157:H7 初始細(xì)菌總數(shù)為7.0 lg(CFU/g)時(shí),0.15 mg/mL 反式肉桂醛處理牛肉餡1 d 后使牛肉餅中大腸桿菌O157:H7 細(xì)菌總數(shù)顯著降低了 3.0(P<0.05),且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性[43]。
蝦類產(chǎn)品作為世界范圍內(nèi)主要的海鮮食品,具有較高的商業(yè)價(jià)值。 但包括鮮蝦在內(nèi)的海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌檢出率較高,這增大了人體感染的風(fēng)險(xiǎn),使得海產(chǎn)品零售產(chǎn)業(yè)受到了限制。 研究結(jié)果表明,反式肉桂醛能夠有效抑制鮮蝦中的副溶血性弧菌。反式肉桂醛已被美國(guó)FDA 認(rèn)證為公認(rèn)安全的食品成分,廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域,它有潛力作為一種天然抑菌劑應(yīng)用于蝦類及其他海產(chǎn)品,其控制海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌具有廣闊的應(yīng)用前景,這對(duì)提升我國(guó)海產(chǎn)品質(zhì)量安全水平具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 然而,反式肉桂醛對(duì)鮮蝦感官品質(zhì)的影響需要在實(shí)際應(yīng)用前進(jìn)一步探討。
探究了反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌的抑制作用機(jī)理及其對(duì)鮮蝦中副溶血性弧菌的控制效果。 結(jié)果表明:反式肉桂醛對(duì)6 株副溶血性弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為50~70 μg/mL,使菌體最大生長(zhǎng)速率顯著減小,最大光密度值顯著降低。 并且,反式肉桂醛使副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性顯著降低并改變了菌體的形態(tài),使菌體干癟塌陷。 反式肉桂醛對(duì)鮮蝦中副溶血性弧菌具有良好的抑菌效果,且抑菌效果隨其質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng),當(dāng)反式肉桂醛質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時(shí)在4 ℃作用鮮蝦,鮮蝦中副溶血性弧菌在1 h 全部降低至檢出限以下。綜上所述,反式肉桂醛對(duì)副溶血型弧菌有著良好的抑菌效果,其是通過(guò)使副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性降低,使細(xì)胞形態(tài)干癟、皺縮發(fā)揮抑菌作用的。 結(jié)合其對(duì)鮮蝦中副溶血型弧菌的抑菌效果,我們認(rèn)為,反式肉桂醛有潛力作為天然抑菌劑應(yīng)用于鮮蝦及其他海產(chǎn)品中控制副溶血型弧菌的感染。