陳葉雨，劉 亞，賴見生，宋明江，龔 全

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 成都 611731)

【研究意義】胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)是一類與胰島素前體具有同源性的細(xì)胞增殖調(diào)控因子，由多種同源多肽組成，在細(xì)胞生長、分化、調(diào)節(jié)滲透壓、繁殖、免疫應(yīng)答和新陳代謝等過程中起著重要的作用[1-3]。自IGFs被發(fā)現(xiàn)具有生長調(diào)節(jié)的功能以來，IGF系統(tǒng)及其衍生功能也被相繼發(fā)現(xiàn)和闡明，特別是IGFs參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子網(wǎng)絡(luò)越來越受到重視。【前人研究進(jìn)展】1989年，Cao等[4]首次從鮭(Oncorhynchustshauytscha)中克隆得到IGF-1cDNA，隨后金魚(Carassiusauratus)[5]、銀大麻哈魚(Oncorhynchuskisutch)[3]、莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[6]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[7]、青鳉(Oryziaslatipes)[8]、虹鱒(O.mykiss)[9]、鯽(Carassiusaurat)[10]、哲羅鮭(Huchotaimen)[11]等IGF相關(guān)基因相繼被克隆。隨著研究深入，IGFs家族基因相繼被發(fā)現(xiàn)，如斑馬魚(Daniorerio)性腺中存在IGF-1a、IGF-1b、IGF-2a和IGF-2b4種亞型[12-13]，最近，家族基因IGF-3也在斑馬魚中被發(fā)現(xiàn)，且具有刺激生殖細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)精巢和卵母細(xì)胞的發(fā)育等功能[14]。IGF-1和IGF-2主要通過IGF-1受體來刺激細(xì)胞反應(yīng)，然而，其功能存在一定的差異[15]。IGF-1主要來源于肝臟，在生殖前期受生長激素GH調(diào)控，在魚類肌肉生長和代謝中起到重要作用[16]。IGF-2參與卵黃的生成，主要作用于胚胎生長和發(fā)育階段，不受生長激素調(diào)節(jié)[17]?！颈狙芯壳腥朦c】達(dá)氏鱘，又名長江鱘，隸屬鱘形目，鱘科，鱘屬，為我國一級保護動物。受人為活動的影響，野生資源急劇下降，現(xiàn)階段主要采取人工保育的方式進(jìn)行種群的擴增[18]。雖然達(dá)氏鱘人工繁殖技術(shù)已獲得突破，但其繁殖生理及生長特性的分子機理有待進(jìn)一步挖掘。本研究通過克隆IGF-1和IGF-2基因，得到了其cDNA全長序列，并研究其在不同組織及饑餓脅迫作用下的表達(dá)模式。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究結(jié)果以期為進(jìn)一步了解IGF-1和IGF-2在達(dá)氏鱘生殖生理和生長過程中的功能奠定基礎(chǔ)，也為下一步良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

達(dá)氏鱘為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所2018年繁殖的F2代，體重為(30±2)g。將實驗魚用MS-222進(jìn)行麻醉，然后解剖。同時將心臟、肝臟、脾臟、腎臟、性腺、肌肉、腸、鰓、皮膚、眼、腦取出，液氮中速凍，然后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 RNA提取及cDNA合成

取上述組織30 mg左右于液氮中研磨，使用Trizol法提取總RNA，提取后取3 μl總RNA樣品通過1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和完整性，用超微量分光光度儀測定RNA樣品的濃度和純度。質(zhì)量檢測合格的RNA樣品參照ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO, Japan)說明書合成第一鏈cDNA。

1.3 IFG-1和IFG-2基因克隆

利用本實驗室前期達(dá)氏鱘轉(zhuǎn)錄組測序獲得的unigene序列為基礎(chǔ)(accession numbers SRR6167299, SRR6172670, SRR6173479, SRR6175 505, SRR6179331和SRR6179394)，通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲得了達(dá)氏鱘IGF-1和IGF-2的cDNA全序列。為驗證序列的正確性，分別在ORF上下游設(shè)計驗證引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物連接載體后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 序列分析

運用Vecter NTI軟件預(yù)測達(dá)氏鱘IGF基因的ORF，并推測其編碼氨基酸序列，計算編碼產(chǎn)物分子量和等電點；信號肽序列使用在線工具SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行預(yù)測。利用Cluxtal X將達(dá)氏鱘的IGF-1和IGF-2序列分別與其他物種的相應(yīng)基因序列進(jìn)行多重比對，利用Mega 6.0軟件的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 組織表達(dá)分析

選取5尾健康達(dá)氏鱘，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測IGF-1和IGF-2基因在達(dá)氏鱘11個組織中的相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括5 μl稀釋后cDNA(原始濃度稀釋20倍)，12.5 μl 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，上下游引物各1 μl(10 μM，表1)，滅菌雙蒸水5.5 μl。PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，42個循環(huán)；最后70～95 ℃獲取溶解曲線并確保擴增產(chǎn)物的特異性。選取β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法計算樣品中IGF基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 饑餓脅迫下達(dá)氏鱘IGF表達(dá)量的檢測

選擇75尾健康、活力好的達(dá)氏鱘進(jìn)行饑餓實驗，為期14 d，實驗期間充氧，水溫25～27 ℃。實驗魚分5組，每組3個平行，分別為對照組(饑餓0 d)、實驗1組(饑餓1 d)、實驗2組(饑餓3 d)、實驗3組(饑餓7 d)和實驗4組(饑餓14 d)。分別在饑餓實驗的0、1、3、7和14 d采集肌肉、腸道及肝臟3個組織的樣本，每個平行采集3尾。每尾樣本取組織約30 mg進(jìn)行液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存。

表1 IGF基因克隆和熒光定量PCR檢測所用引物

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±S.E.)表示實驗數(shù)據(jù)，采用SPSS22.0軟件處理結(jié)果?；趩我蛩胤讲罘治龌A(chǔ)上，采用Ducan多重比較法對組間差異進(jìn)行檢驗，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 達(dá)氏鱘IGF-1和IGF-2克隆及序列分析

達(dá)氏鱘IGF-1基因的cDNA全長為2622 bp(GenBank序號為MK955784)，見圖1。其中，5′非編譯區(qū)為292 bp，開放閱讀框為489 bp，3′非編譯區(qū)為1841 bp，3’UTR區(qū)域有明顯的多聚腺苷酸化信號AATAAA序列。序列分析表明，達(dá)氏鱘IGF-1cDNA的ORF編碼包括信號肽、成熟肽(B、C、A、D)和E區(qū)6個區(qū)域共162個氨基酸。去掉信號肽和E區(qū)域后，達(dá)氏鱘IGF-1包含71個氨基酸殘基的成熟肽，可劃分為B區(qū)(29個氨基酸)、C區(qū)(12個氨基酸)、A區(qū)(21個氨基酸)、D區(qū)(9個氨基酸)，分子量為8.0 kDa，等電點(pI)為8.64。

達(dá)氏鱘IGF-2基因的cDNA全長為1821 bp(GenBank序號為MK955785)，見圖2。其中，5′非編譯區(qū)為109 bp，開放閱讀框為660 bp，3′非編譯區(qū)為1052 bp，3’UTR區(qū)域有明顯的多聚腺苷酸化信號AATAAA序。序列分析表明，達(dá)氏鱘IGF-2cDNA的ORF編碼包括信號肽、成熟肽(B、C、A、D)和E區(qū)6個區(qū)域共219個氨基酸。去掉信號肽和E區(qū)域后，達(dá)氏鱘IGF-2包含70個氨基酸殘基的成熟肽，可劃分為B區(qū)(32個氨基酸)、C區(qū)(10個氨基酸)、A區(qū)(21個氨基酸)、D區(qū)(7個氨基酸)，分子量為7.8 kDa，等電點(pI)為8.30。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將達(dá)氏鱘的IGF-1和IGF-2分別和其他物種相應(yīng)的IGF序列進(jìn)行比對，采用Mega 6繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3。結(jié)果顯示，達(dá)氏鱘的IGF-1和IGF-2均可與其他物種的IGF亞型聚類，其中，IGF-1與波斯鱘聚為一支，IGF-2與史氏鱘聚為一支，表明在進(jìn)化上與鱘形目的魚類親緣較近。

2.3 不同組織中IGFs的表達(dá)水平

達(dá)氏鱘IGFs在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、性腺、肌肉、腸、鰓、皮膚、眼、腦組織中均有表達(dá)，其表達(dá)量在各組織中不盡相同(圖4)。其中，IGF-1在眼睛中的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織(P<0.05)，肝臟和性腺次之，在脾臟、鰓、腎臟中表達(dá)量較小，在皮膚中表達(dá)量最低。IGF-2在肝臟中的表達(dá)量最高，性腺次之，顯著高于其他組織(P<0.05)，在腸道、脾臟中表達(dá)量較小，同IGF-1類似，IGF-2在皮膚中的表達(dá)量最低。

2.4 饑餓脅迫下達(dá)氏鱘IGFs表達(dá)量的變化

達(dá)氏鱘肝臟、腸和肌肉組織中IGF-1和IGF-2mRNA表達(dá)量在饑餓期間出現(xiàn)不同的變化。饑餓1 d后，肝臟和腸道中的IGF-1呈現(xiàn)上升的趨勢(圖5)，隨后第3、7和14天時的表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)。而肌肉中的IGF-1在第3、7天時出現(xiàn)下降趨勢，但相較于第0天的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，饑餓14 d，其表達(dá)量開始出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)。IGF-2在饑餓第1天后也出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(圖6)，但饑餓第3、7和14天時其表達(dá)量在所有檢測的組織中與第0天相比均無顯著差異(P>0.05)。

灰色陰影部分表示起始密碼子，*表示終止密碼子，方框內(nèi)為多聚腺苷酸化信號The initiation codon was highlighted in light grey and termination codon was shown by * while the polyadenylation signal was in box

灰色陰影部分表示起始密碼子，*表示終止密碼子，方框內(nèi)為多聚腺苷酸化信號The initiation codon was highlighted in light grey and termination codon was shown by * while the polyadenylation signal was in box

圖3 達(dá)氏鱘IGFs與其他脊椎動物的系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討 論

20世紀(jì)90年代以來，國內(nèi)外學(xué)者已成功分離出魚類的IGF-1和IGF-2基因cDNA序列[3-11]。研究發(fā)現(xiàn)，不同魚類的IGF cDNA序列同源性高，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)高度保守[19]。達(dá)氏鱘IGF-1和IGF-2由信號肽和B、C、A、D、E 5區(qū)組成，IGF-1和IGF-2的相似性為42.1 %。通過與其他魚類的氨基酸多重對比，B、C、A、D保守性較高，信號肽及E區(qū)同源性較差。達(dá)氏鱘IGF-1與史氏鱘(A.schrenckii)、密西西比鏟鱘(Scaphirhynchusplatorynchus)的同源性較高，均為96 %，與其他物種的同源性則為60 %左右。IGF-2與與歐鰉(Husohuso)、西伯利亞鱘(A.baeri)、小體鱘(A.ruthenus)、波斯鱘(A.persicus)的同源性較高，均在90 %以上，與其他物種的同源性為70 %左右。達(dá)氏鱘隸屬鱘屬，從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，達(dá)氏鱘與史氏鱘、密西西比鏟鱘、歐鰉、西伯利亞鱘、小體鱘、波斯鱘等IGF的同源性很高，與分類地位相近的鱘、鰉等出現(xiàn)在同一分支，與鯉形目、鮭形目等魚類相距較遠(yuǎn)，這與其傳統(tǒng)分類地位相一致。

不同字母表示差異達(dá)到顯著水平The different letters stand for significant difference

圖5 饑餓脅迫下不同組織中IGF-1的相對表達(dá)量

圖6 饑餓脅迫下不同組織中IGF-2的相對表達(dá)量

一般情況下，IGFs對肌肉、腦、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生長等都有重要作用[20]，其主要在肝臟中表達(dá)，在其他組織也有一定的表達(dá)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1和IGF-2在腸、肝臟、肌肉、腦、皮膚、脾臟、鰓、腎臟、心臟、性腺和眼睛中均有表達(dá)，也充分證明IGFs在達(dá)氏鱘中是一個廣泛表達(dá)的基因。近年來研究表明，IGF-2主要與動物的胚胎生長和發(fā)育相關(guān)，IGF-1主要負(fù)責(zé)動物的胚后生長。Manfred[22]等研究發(fā)現(xiàn)，莫桑比克羅非魚大部分器官組織都能分泌IGF-1，如肝、胰、胃、腸、腎、生殖腺、腦、心和眼等，這些器官和組織通過自分泌、旁分泌方式分泌IGF-1，然后通過IGF-1調(diào)節(jié)來發(fā)揮生物效應(yīng)。2007年，Otteson[22]等發(fā)現(xiàn)IGF-1和IGF-1R在視網(wǎng)膜中表達(dá)，并顯著高于其它組織，外源的GH能顯著提高靶組織中IGF-1的表達(dá)量，并提高視網(wǎng)膜原始細(xì)胞擴增。本研究中，IGF-1在達(dá)氏鱘眼睛中表達(dá)量最高，推測其可能參與到達(dá)氏鱘眼睛視網(wǎng)膜的發(fā)育過程中。其次，IGF-1在肝臟中也有較高的表達(dá)，但腸、皮膚、脾臟、鰓、腎臟中的表達(dá)量低，這與其他硬骨魚中IGF-1的表達(dá)模式相似，說明IGF-1主要由肝臟參與合成，少數(shù)可由其他器官產(chǎn)生和分泌[24-25]。IGF-2在魚類的多組織中表達(dá)，是控制動物生長和脂肪沉積的重要基因之一。不同魚類各組織IGF-2的表達(dá)量不盡相同，其中，鯉(Cyprinuscarpio)、半滑舌鰨(Soleasenegalensis)、金頭鯛(Sparusaurata)等魚類中肝臟的IGF-2表達(dá)量最高，鱖(Sinipercachuatsi)在腦中表達(dá)量最高，三長棘赤鯛(Pagrusauriga)在鰓和心臟中表達(dá)量最高[26]。IGFs是生長軸和生殖軸相交聯(lián)的關(guān)鍵因子，性腺中也存在生長激素生長調(diào)控軸和一些性腺局部的調(diào)節(jié)因子，準(zhǔn)確調(diào)控卵巢發(fā)育與成熟的變化。Cao[4]等研究發(fā)現(xiàn)，魚類IGF-2參與魚類性腺發(fā)育過程，能誘導(dǎo)魚類卵母細(xì)胞成熟和顆粒細(xì)胞的增殖與分化。林權(quán)卓[23]等通過對雙棘黃姑魚的研究發(fā)現(xiàn)，IGF-2在各組織中均廣泛表達(dá)，在卵巢成熟期的IGF-2表達(dá)量較高，具有促進(jìn)卵巢成熟的作用。Sharon[21]等研究發(fā)現(xiàn)，IGF-2在卵泡層和卵母細(xì)胞均有表達(dá)，更多的參與動物繁殖旁分泌/自分泌系統(tǒng)。Gentil等[27]通過觀察虹蹲性周期發(fā)現(xiàn)，IGF-2參與卵黃的生成，在魚類生長發(fā)育中具有重要生理作用。本研究中，IGF-2在不同組織中出現(xiàn)一定的差異表達(dá)，除肝臟以外，該基因在性腺的表達(dá)量顯著高于其他組織，由于本實驗所用達(dá)氏鱘樣本正處于早期性腺分化階段，所以推測IGF-2可能參與到達(dá)氏鱘生殖細(xì)胞發(fā)育和早期性腺分化等途徑中。

饑餓條件下，魚類的激素分泌、糖源合成代謝[28]、脂肪代謝[29]和能量收支[30]會發(fā)生一定的改變。IGFs的表達(dá)和活性與營養(yǎng)狀況呈正相關(guān)的關(guān)系，魚類在受到饑餓脅迫時GH和IGF-1會迅速進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)。沈文英等[31]分析了饑餓和恢復(fù)投喂條件下，異育銀鯽肝臟IGF-1表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)饑餓期肝臟IGF-1mRNA表達(dá)量呈下降趨勢，恢復(fù)投喂后血液中的IGF-1迅速恢復(fù)到對照組水平。Wood等[32]研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)狀況通過調(diào)節(jié)IGF的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)對IGF的調(diào)控，長期饑餓將導(dǎo)致血液中IGF-1水平的持續(xù)降低。本研究結(jié)果顯示，在饑餓條件下，肝、腸和肌肉組織中的IGF-1總體呈下調(diào)表達(dá)的趨勢，與斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[33]、紅點鮭(Salvelinusalpinus)[34]、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[35]的研究結(jié)果相似。饑餓時間與IGFs的表達(dá)也存在一定的關(guān)系，尼羅羅非魚[36]在饑餓7 d后，肝胰臟mRNA表達(dá)豐度明顯降低，異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[31]在饑餓第14天后IGFs表達(dá)顯著降低，大口黑鱸(Micropterussalmoides)[37]在禁食3周后，肝臟中的IGF-1mRNA水平顯著低于對照組。然而，與以往魚類研究不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)IGFs的表達(dá)量在饑餓短時間內(nèi)出現(xiàn)小幅度的上升，隨后逐漸下降，這與小鼠在48 h內(nèi)的IGF-1mRNA表達(dá)量變化趨勢一致[38]。除此以外，本研究還發(fā)現(xiàn)，肝臟和腸道的IGF-1表達(dá)量在饑餓第3天開始就出現(xiàn)顯著下降，而肌肉中的IGF-1表達(dá)量在第14天時才開始顯著下降，推測達(dá)氏鱘IGF-1在肌肉中對于饑餓脅迫的響應(yīng)時間要慢于肝臟和腸道。而達(dá)氏鱘IGF-2在饑餓脅迫下的表達(dá)模式與IGF-1存在較大差別。在饑餓第1天時，IGF-2在檢測的各組織中均迅速上調(diào)表達(dá)，但在隨后的第3天開始就下降到初始表達(dá)水平，隨后其表達(dá)量與第0天相比均無顯著差異，到饑餓第14天時也無顯著下降，推測IGF-2可能不參與達(dá)氏鱘饑餓脅迫響應(yīng)的途徑中。IGF-1和IGF-2對饑餓脅迫的不同響應(yīng)模式也進(jìn)一步說明IGF-1和IGF-2在達(dá)氏鱘中行使著不同的生物學(xué)功能。

4 結(jié) 論

本研究首次克隆了達(dá)氏鱘IGF-1和IGF-2兩種胰島素樣生長因子的cDNA全長序列，并分析了其組織分布和在饑餓脅迫下的表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)饑餓脅迫會顯著影響達(dá)氏鱘IGF-1mRNA的表達(dá)水平，而IGF-2的表達(dá)模式整體無顯著變化，推測該2種胰島素樣生長因子在達(dá)氏鱘中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。IGFs是一類重要的生長調(diào)控因子，本研究可作為達(dá)氏鱘生長調(diào)控、營養(yǎng)調(diào)控與基因表達(dá)模式關(guān)系的研究基礎(chǔ)，如今后把該基因作為主效功能基因用于分子標(biāo)記輔助育種，將更好的促進(jìn)該物種的選育與保護。