高婭蓉，熊康寧，袁周偉，苑曉偉，譚 超，陳曉曉，宋月華

(貴州師范大學(xué) 喀斯特研究院/國(guó)家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550001)

【研究意義】DNA條形碼 (DNA Barcoding) 技術(shù)是昆蟲基因組中一段被公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確鑒定物種，對(duì)物種分類和系統(tǒng)發(fā)育研究有著重要意義[1]。種屬的分類鑒定是小葉蟬亞科昆蟲研究的重要內(nèi)容，受形態(tài)學(xué)鑒定與傳統(tǒng)分類的局限，葉蟬分類學(xué)的發(fā)展急需新技術(shù)的支撐[2]。DNA條形碼的分子分類方法能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類的缺憾[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】基于線粒體DNA COI基因的條形碼技術(shù)的物種鑒定手段在其他類昆蟲鑒定中已有廣泛應(yīng)用[4-7]。張媛等[8]對(duì)鞘翅目昆蟲COI基因的序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建指出，DNA條形碼技術(shù)在鞘翅目昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。戴仁懷等[9]基于線粒體COI基因?qū)χ袊?guó)常見的廣頭葉蟬亞科種類進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，為物種快速鑒定打下了基礎(chǔ)。胡澤章等[10]研究證明，運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)小花蝽屬昆蟲進(jìn)行物種快速分子鑒定是可行的?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】應(yīng)用于DNA條形碼工作中的基因很多，但線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基基因(COI)擁有相對(duì)保守性的特點(diǎn)，種間變異較大，合適的序列長(zhǎng)度能提供豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息，是目前測(cè)序最多、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化動(dòng)力學(xué)研究較清楚的基因，已被廣泛應(yīng)用于近緣種間的系統(tǒng)分類研究[11]。小葉蟬亞科為葉蟬科第二大亞科，種類很多，而在小葉蟬亞科的低級(jí)階元，近緣種普遍存在，根據(jù)傳統(tǒng)分類學(xué)方法很難區(qū)分，采取新的特征和手段，可為近似種的鑒定提供更為可靠的證據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對(duì)小葉蟬亞科物種進(jìn)行鑒定，旨在彌補(bǔ)小葉蟬亞科傳統(tǒng)分類方法的不足[12]，為近似種難以從形態(tài)上鑒定區(qū)分的問(wèn)題提供更為可靠的依據(jù)[13]，該鑒定方法快速、方便且準(zhǔn)確，對(duì)物種精確鑒定、生物多樣性評(píng)估和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系方面的研究具有重要意義和科學(xué)價(jià)值[14]。為能快速、準(zhǔn)確地鑒定小葉蟬亞科種類，通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)小葉蟬亞科5個(gè)族的線粒體COI基因片段序列進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，然后將同源序列的堿基多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析[15]，探討線粒體COI基因片段作為DNA條形碼準(zhǔn)確鑒定小葉蟬亞科昆蟲種類的可行性，以期為更進(jìn)一步研究小葉蟬亞科昆蟲分子鑒定技術(shù)提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

葉蟬標(biāo)本于2017年8月和2018年6月在貴州梵凈山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)采集，浸泡于無(wú)水乙醇中，保存于貴州師范大學(xué)喀斯特研究院6樓實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃冰箱備用。選取的2種標(biāo)本類型分別編號(hào)為YXYC(眼小葉蟬族Alebrini)與 XLYC(小綠葉蟬族Empoascinisp.)。對(duì)比COI基因序列源于從基因庫(kù)GenBank中下載的20種小葉蟬亞科昆蟲COI基因序列(表1)。

動(dòng)物組織快速提取試劑盒 (VWI)Easy Pure Genomic DNA kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取出無(wú)水乙醇保存的葉蟬標(biāo)本，除去腹部和翅膀，然后將其余的動(dòng)物組織使用無(wú)菌研磨棒將其磨成粉末狀置于無(wú)菌的1.5 mL離心管中，然后按照動(dòng)物組織快速提取試劑盒說(shuō)明書提取總DNA，檢測(cè)樣品的濃度和純度后馬上保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 COI基因擴(kuò)增及測(cè)序 ①引物合成。通過(guò)文獻(xiàn)查找篩選適合的COI通用引物[16]，引物均由上海生物工程有限公司合成。COI引物分為COIF(上游引物)：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；COIR(下游引物)：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。②PCR反應(yīng)體系。2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)25 μl，模板DNA 2 μl，上下游引物各1 μl，加ddH2O 21 μl，總共50 μl。PCR主要反應(yīng)過(guò)程：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共有34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后由上海生物工程有限公司進(jìn)行直接測(cè)序。

1.2.3 序列處理與分析 測(cè)序后得到的結(jié)果使用Chromas進(jìn)行讀取與確認(rèn)。運(yùn)用MEGA6.0進(jìn)行序列的拼接與手工校正，確定分析的序列[17]。利用NCBI中的BLAST進(jìn)行相似性檢索，確定序列方向及目的片段；將確定的序列及Genbank中下載的20種小葉蟬的基因序列載入Clustal X 1.83[18]進(jìn)行序列比對(duì)，輸出格式為FASTA。比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入MEGA6.0[19]計(jì)算各物種間的遺傳距離[20]，轉(zhuǎn)換和顛換值及其比值(R值)，保守位點(diǎn)(Conserved sites，C)及變異位點(diǎn)(Variable sites，V)等數(shù)值[21]?；贛EGA6.0運(yùn)用鄰接法(Neighbor-Joining， NJ)與Kimura 2-parameter遺傳距離模型[22]分析20種小葉蟬物種同2個(gè)外群物種YXYC(眼小葉蟬族)與XLYC(小綠葉蟬族)間的遺傳距離和采用Bootstrap重復(fù)抽樣1000次用以檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹每個(gè)分支的置信度，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因序列組成與變異

葉蟬測(cè)序得到的結(jié)果及基因庫(kù)下載的相關(guān)小葉蟬序列運(yùn)用MEGA6.0拼接剪切成統(tǒng)一長(zhǎng)度(646 bp)的片段，沒(méi)有出現(xiàn)缺失和插入的情況。變異位點(diǎn)為512個(gè)，保守位點(diǎn)134個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)415個(gè)，自裔位點(diǎn)97個(gè)。整個(gè)序列結(jié)構(gòu)中A、G、C和T堿基組成的含量分別為27.6 %、15.5 %、15.3 %和41.6 %。A+T含量為69.2 %，明顯高于G+C含量，呈現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏好，滿足昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征[23]。

表1 小葉蟬亞科線粒體COI基因片段信息

2.2 堿基替換

從表2看出，全部位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換產(chǎn)生于T和C間，顛換主要發(fā)生在A與T間，轉(zhuǎn)換/顛換比值(R)為0.63。密碼子位點(diǎn)分析，轉(zhuǎn)換與顛換主要產(chǎn)生在密碼子第3位點(diǎn)，R為0.81，轉(zhuǎn)換與顛換數(shù)值鄰近，符合昆蟲線粒體特別屬性，替換主要產(chǎn)生在密碼子第3位點(diǎn)。第1位點(diǎn)、2位點(diǎn)和第3位點(diǎn)的R分別為0.58、0.57和0.81。整體與密碼子各位點(diǎn)的R均小于2，表明該段序列的轉(zhuǎn)換與顛換沒(méi)有達(dá)到飽和，一般在建立系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)需要考慮轉(zhuǎn)換與顛換的發(fā)生比率；說(shuō)明該段基因準(zhǔn)確度高，運(yùn)用該基因得到的進(jìn)化樹是具有準(zhǔn)確性的。

2.3 遺傳距離

從表3看出，小綠葉蟬族葉蟬物種間的遺傳距離為0.021～0.284，眼小葉蟬族間的種內(nèi)改為間遺傳距離刪除相差最大，為2.57。不同葉蟬物種間的遺傳距離在0.292～6.183，物種間的平均遺傳距離為0.204，其中近緣種叉脈葉蟬族與小葉蟬亞科間的遺傳距離最小，為0.017；蛇葡萄斑葉蟬和眼小葉蟬族間的遺傳距離最大，為7.491。由此可知，相同葉蟬物種間不受地理位置的影響；葉蟬同一屬種的種間遺傳距離差異較明顯，將此段序列運(yùn)用于分析和鑒別物種的依據(jù)具有可行性。

表2 小葉蟬亞科的核苷酸堿基替換值

表3 22種小葉蟬種內(nèi)的種間遺傳距離及標(biāo)準(zhǔn)誤差

注：對(duì)角線以下為遺傳距離， 對(duì)角線以上為標(biāo)準(zhǔn)誤差。1，眼小葉蟬族；2，叉脈葉蟬族；3，凱小綠葉蟬；4，馬鈴薯小綠葉蟬；5，小葉蟬亞科；6，茶小綠葉蟬；7，小葉蟬亞科；8，叉脈葉蟬族；9，假眼小綠葉蟬；10，蛇葡萄斑葉蟬；11，小葉蟬亞科；12，小葉蟬亞科； 13，小綠葉蟬屬；14，小綠葉蟬屬；15，小綠葉蟬屬；16，切爾塔斑葉蟬；17，小綠葉蟬屬；18，蛇葡萄斑葉蟬；19，小綠葉蟬屬；20，小綠葉蟬屬；21，番木瓜小綠葉蟬；22，小綠葉蟬屬。

Note：The values below the diagonal and above the diagonal are genetic distance and standard error respectively.. 1,Alebrini；2,Dikraneurini; 3,Empoascakaicola; 4,Empoascafabae; 5, Typhlocybinae; 6,Empoascaonukii; 7, Typhlocybinae; 8,Dikraneurasp.; 9,Empoascavitis; 10,Erythroneuratricincta; 11, Typhlocybinae; 12, Typhlocybinae ; 13,Empoascasp.; 14,Empoascasp.; 15,Empoascasp.; 16,Erythroneuracerta; 17,Empoascasp.; 18,Erythroneuratricinct; 19,Empoascasp.; 20,Empoascasp.; 21,Empoascapapaya; 22,Empoascasp.

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從圖1看出，兩種外群YXYC(眼小葉蟬族Alebrini) 與XLYC(小綠葉蟬族Empoascinisp.)位于樹的基部，說(shuō)明，叉脈葉蟬族和眼小葉蟬族種類親緣關(guān)系較近且較原始，這與形態(tài)學(xué)分類相一致。與內(nèi)群其他小葉蟬亞科種類分開。不同兩個(gè)外群種均屬小葉蟬亞科，聚為同一支，形成姐妹群，且分支自展值均為 100 %；在內(nèi)群中，近緣種能聚集在一起，如MF931089和KR567994兩個(gè)未分類的小葉蟬種類，其置信度也很高(≥97 %)。同族間的KJ867505和KJ867506親緣關(guān)系最相近，不同種的KR564575和KR570673差異明顯。總的來(lái)說(shuō)，葉蟬種類間的親緣關(guān)系與形態(tài)學(xué)的劃分基本一致。

3 討 論

對(duì)小葉蟬亞科的COI基因序列進(jìn)行拼接與手工校正，并采用基因庫(kù)中Blast進(jìn)行序列的相似性分析結(jié)果表明，所測(cè)序列都屬于小葉蟬亞科，COI基因序列且同源性均在98 %以上，說(shuō)明此段序列準(zhǔn)確性強(qiáng)、可信度高。同時(shí)，在小葉蟬亞科中，眼小葉蟬族和叉脈葉蟬族的親緣關(guān)系較近，而小綠葉蟬族和斑葉蟬族的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以線粒體基因COI序列信息為基礎(chǔ)的DNA條形碼技術(shù)能有效地對(duì)形態(tài)特征變異豐富的小葉蟬亞科昆蟲進(jìn)行物種鑒定[24]。在此基礎(chǔ)上，采用Kimura 2-parameter 雙參數(shù)模型建立而成的NJ樹，相同葉蟬物種類型聚為同一小支，且分支自展值為100 %；葉蟬物種間的近緣種聚集在一起，置信度相對(duì)較高(≥97 %)；不同葉蟬物種間差異表現(xiàn)較明顯，置信度較高，系統(tǒng)進(jìn)化樹得出的結(jié)果與葉蟬的形態(tài)學(xué)分類結(jié)果基本一致，可以滿足葉蟬種類分類鑒定的需要?；诰€粒體COI基因的DNA條形碼技術(shù)是可以作為小葉蟬亞科物種鑒定的有利工具，對(duì)小葉蟬亞科昆蟲分子鑒定具有可行性。

分支處上方數(shù)值表示重復(fù)1000次后的自展值The value above branches is bootstrap value (1000 replicates)

4 結(jié) 論

葉蟬測(cè)序得到的結(jié)果及基因庫(kù)下載的相關(guān)小葉蟬序列運(yùn)用MEGA6.0拼接剪切成統(tǒng)一長(zhǎng)度(646 bp)的片段，沒(méi)有出現(xiàn)缺失和插入的情況。變異位點(diǎn)為512個(gè)，保守位點(diǎn)134個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)415個(gè)，自裔位點(diǎn)97個(gè)。整個(gè)序列結(jié)構(gòu)中A、G、C和T堿基組成的含量分別為27.6 %、15.5 %、15.3 %和41.6 %。A+T含量為69.2 %，明顯高于G+C含量，呈現(xiàn)出明顯的A+T堿基偏好，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征。轉(zhuǎn)換與顛換結(jié)果顯示：該段序列沒(méi)有飽和，可以得到準(zhǔn)確的進(jìn)化分析。同物種間與不同物種間的遺傳距離分別為0.025～0.044和0.024～0.291，平均為0.358?；贑OI基因序列構(gòu)建的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)顯示，同一物種聚為同一小支，分支自展值均為100 %：近緣種能聚集在一起，且置信度很高(≥97 %)。結(jié)果表明，昆蟲COI序列能夠區(qū)分不同物種，COI基因片段的DNA條形碼進(jìn)行小葉蟬亞科昆蟲分類鑒定具有可行性。