丁盛娣 唐杰 徐彬 張文淵

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）是妊娠期特有的并發(fā)癥，孕婦預(yù)后良好，但可導(dǎo)致胎膜早破、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫、羊水胎盤糞染及不可預(yù)測的胎兒突然死亡、新生兒顱內(nèi)出血等不良妊娠結(jié)局［1］，其病理機(jī)制尚不明確。近年來研究表明，ICP 孕婦血清中高濃度膽汁酸可通過促進(jìn)游離胎盤絨毛間隙狹窄，胎兒胎盤的血循環(huán)受阻，胎盤血流阻力增加，胎兒宮內(nèi)缺血缺氧，最終導(dǎo)致胎盤灌注不足，從而影響胎兒預(yù)后不良的發(fā)生率升高［2］。水通道蛋白1（AQP1）是一種高度保守的疏水跨膜結(jié)合蛋白，主要表達(dá)于紅細(xì)胞膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞，廣泛分布于人體的各個(gè)組織，主要作用是顯著增加細(xì)胞膜對水的通透性，參與水的分泌、吸收及細(xì)胞內(nèi)外水的平衡調(diào)節(jié)。本文探討ICP 孕婦與胎盤灌注及胎盤組織上AQP1 mRNA 和蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015 年1 月至2018 年10 月本院產(chǎn)科急診剖宮產(chǎn)的ICP 孕婦30 例為ICP 組，ICP 診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）生化指標(biāo)：血清總膽汁酸≥10μmol/L，肝膽酸≥10.75μmol/L；（2）臨床癥狀：有或無瘙癢；有或無黃疸。且均未接受過任何藥物治療的患者。同期選取無任何并發(fā)癥的正常足月妊娠剖宮產(chǎn)的產(chǎn)婦30例為正常對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)婦年齡24～28 歲，均系足月單胎，無其他妊娠合并癥和并發(fā)癥，如：糖尿病、高血壓、心血管疾病或者自身免疫疾病等，無催產(chǎn)素引產(chǎn)史，無藥物服用史，無過期妊娠、胎兒畸形、胎兒生長受限及胎膜早破。本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有產(chǎn)婦均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）材料：Real-Time PCR 反應(yīng)試劑均購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）；引物GAPDH、AQP1、委托美國ABI 公司合成；兔抗大鼠AQP1 抗體（Abcam 公司），HRP 標(biāo)記羊抗人IgE 二抗購于北京中杉金橋公司；化學(xué)發(fā)光底物試劑盒垂直板型電泳儀、膜轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)均購自Bio-Rad 公司；低溫高速冷凍離心機(jī)購自Eppdof 公司；彩色多普勒超聲診斷儀購自美國GE 公司。（2）術(shù)前B 超監(jiān)測：剖宮產(chǎn)術(shù)前床邊B 超測量子宮動(dòng)脈血流阻力指數(shù)（RI）、搏動(dòng)指數(shù)（PI），以評估孕婦子宮胎盤灌注狀態(tài)。（3）取材：符合診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)術(shù)中胎盤娩出離體后取胎盤、胎膜及臍帶組織，分裝后置入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）檢測方法：①兩組足月孕婦取仰臥位進(jìn)行超聲檢查，探頭頻率為3.5MHz，先對胎兒雙頂徑、胎盤、臍帶、羊水等各個(gè)部位的情況進(jìn)行檢查，最后掃查胎盤基底部的子宮螺旋動(dòng)脈，連續(xù)獲取5 個(gè)心動(dòng)周期的血流信號，計(jì)算RI 和PI。②Real-time PCR 檢測胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 mRNA 表達(dá):Trizol 試劑盒提取胎盤、胎膜及臍帶中的總RNA，采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR 檢測AQP1 的表達(dá)，25μl反應(yīng)體系包括：20×TaqMan Gene Expression Assay 1.25μl，2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μl，cDNA 模 板3μl，補(bǔ)DEPC 無 菌 水 至25μl。PCR 循環(huán)參數(shù)為：95℃ 10min 預(yù)變性；然后95℃ 15s，60℃ 1min，并檢測熒光信號，共40 個(gè)循環(huán)。引物: AQP1:正義鏈為5'-GGAGATGAAGCCCAAATAGAG-3'，反義鏈 為5'-GCTCTGAGACCAGGAAACAGA-3'；GAPDH 正義鏈為5'-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，反義鏈為5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3'。GAPDH 作 為 內(nèi)參。每個(gè)樣本重復(fù)3 次取平均值，反應(yīng)結(jié)束后得出熒光反應(yīng)曲線及CT 值。采用2-ΔΔCT 方法進(jìn)行相對定量。③Western-blot 法檢測胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 蛋白表達(dá)：蛋白裂解液提取胎盤、胎膜及臍帶中蛋白質(zhì)，用BCA 法測定蛋白質(zhì)的濃度，制備聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）（12%分離膠，5%積層膠），取各樣本30μg 進(jìn)行蛋白質(zhì)的SDS-PAGE，電泳結(jié)束后切取目標(biāo)蛋白，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，4% 脫脂牛奶封閉2h 后加入一抗（兔抗，1 ∶1000）4℃過夜，洗膜后加入HRP 標(biāo)記的二抗（鼠抗，1 ∶2000）孵育，洗滌后與ECL 發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光洗片，掃描圖像后Bio-Rad 圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各條帶的灰度值，以β-actin 作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用Mann-Whitney U 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦胎盤灌注的超聲特征 ICP 組孕婦子宮螺旋動(dòng)脈PI 和RI 均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 ICP組與正常對照組孕婦胎盤灌注的超聲參數(shù)［m/s，（±s）］

表1 ICP組與正常對照組孕婦胎盤灌注的超聲參數(shù)［m/s，（±s）］

注：與正常對照組比較，*P＜0.05

組別 n PI RI ICP組 30 0.631±0.085* 0.497±0.043*正常對照組 30 0.302±0.030 0.332±0.002

2.2 兩組胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 mRNA 的表達(dá) Real-time PCR 結(jié)果顯示，ICP 組產(chǎn)婦胎盤、胎膜及臍帶中AQP1mRNA 的表達(dá)均較正常對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且ICP 組中胎盤、胎膜中表達(dá)量較臍帶中表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 ICP組及正常對照組各組織中AQP1mRNA的表達(dá)（±s）

表2 ICP組及正常對照組各組織中AQP1mRNA的表達(dá)（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05

組別 n 胎盤 胎膜 臍帶ICP組 30 6.0237±1.276* 3.176±0.961* 5.997±0.803*正常對照組 30 1.045±0.141 1.178±0.254 1.031±0.200

2.3 兩組胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，ICP 組產(chǎn)婦胎盤、胎膜及臍帶中AQP1 蛋白的表達(dá)均較正常對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且ICP 組中胎盤、胎膜中表達(dá)量較臍帶中表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 ICP組和正常對照組各組織中AQP1蛋白質(zhì)的表達(dá)

3 討論

有學(xué)者對ICP 產(chǎn)婦的胎盤病理檢查發(fā)現(xiàn)胎盤小葉存在改變，絨毛間隙明顯充血水腫，胎盤血流量不足，致使胎兒不能從母體中攝取足夠的營養(yǎng)和氧氣，繼而影響其生長發(fā)育［3］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度膽汁酸有濃度依賴性血管收縮作用，可使胎盤絨毛靜脈痙攣，影響胎盤血流灌注，進(jìn)而影響胎兒營養(yǎng)及氧的交換，導(dǎo)致胎兒慢性低氧，甚至突然死亡［4］。本資料顯示，ICP 發(fā)生時(shí)子宮動(dòng)脈血流阻力指數(shù)及搏動(dòng)指數(shù)均較正常對照組明顯增加，從影像學(xué)上闡明胎盤血流灌注不足的存在，對早期干預(yù)、防止不良妊娠結(jié)局發(fā)生有較好的提示作用。

AQP1 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)識的水通道蛋白，目前對其分子結(jié)構(gòu)和生化特性的研究較為深入，其廣泛分布于人體的各個(gè)組織，在產(chǎn)婦胎盤組織表達(dá)也多次被報(bào)道［5-6］。其不僅能影響機(jī)體的水和甘油代謝，且與羊水生成、轉(zhuǎn)運(yùn)也密切相關(guān)，在影響胎盤血流灌注方面的研究也初有成果［7］，但AQP1 在ICP 中是否參與胎盤血流灌注不足的問題尚未見報(bào)道。

本資料結(jié)果顯示，ICP 組產(chǎn)婦胎盤、胎膜及臍帶上AQP1 的表達(dá)較正常對照組明顯升高，表明ICP 發(fā)生時(shí)胎盤灌注嚴(yán)重不足，AQP1 發(fā)生代償性改變以期增加胎盤的血流。Zhang 等［8］研究中，采用實(shí)時(shí)定量PCR 和免疫組化方法，證實(shí)AQP1 在人胎盤的血管內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)，認(rèn)為AQP1 在維持胎盤灌注方面起重要作用。陳利瓊等［9］研究發(fā)現(xiàn)子癇前期組胎盤上AQP1 的表達(dá)較正常妊娠組明顯上調(diào)，提示胎盤組織中AQP1 的表達(dá)與子癇前期胎盤血管痙攣、胎盤灌注不足相關(guān)。

綜上所述，ICP 胎盤發(fā)生灌注不足時(shí)，AQP1 會發(fā)生代償性增加，提示可以對ICP 導(dǎo)致的不良妊娠結(jié)局提前干預(yù)，后續(xù)作者將對AQP1 在ICP 孕婦胎盤中作用的信號通路進(jìn)一步研究。