葉夢瑤 鄒文靜 茅瑛琦 陳煜陽 潘曉蕓 裘濤

腦卒中是重大公共衛(wèi)生問題［1］。卒中后抑郁（Poststroke depression，PSD）作為最常見的卒中相關(guān)情緒障礙［2］，其發(fā)病率在第1 年約為20%～50%，在卒中后的前6 個月達(dá)到高峰［3］，卒中后＜5 年可能影響1/3 的患者［4］。PSD 危險因素包括年齡、性別、抑郁病史、認(rèn)知障礙、個性、卒中及殘疾的嚴(yán)重程度、卒中的位置、社會支持等［5］，其可能機(jī)制包括神經(jīng)遞質(zhì)假說、免疫失衡假說，涉及神經(jīng)解剖學(xué)、神經(jīng)遺傳學(xué)和社會心理學(xué)［6］。3，6’-二芥子?；崽牵―ISS）是遠(yuǎn)志的主要活性成分之一，具有抗抑郁［7］、腦保護(hù)［8］和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用［9］。2016 年6 月至2017 年10 月作者通過實驗研究，探討DISS 對腦卒中后抑郁大鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD 大鼠50 只（220～270g），清潔級，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，批號：SCXK（滬）2012-0002。實驗于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心進(jìn)行，以5 只/籠群養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)安放大鼠，更換墊料1 次/2d，保持籠內(nèi)環(huán)境清潔，保持晝夜更替，給予正常飲食，飼養(yǎng)2 周，予抓取1次/2d，使其適應(yīng)動物房環(huán)境以及實驗操作人員。

1.2 建立大鼠腦缺血模型 在改良Zea-Longa 線栓法［16］基礎(chǔ)上通過大腦中動脈栓塞（MACO）法建立大鼠腦卒中模型。4h 后，利用Bederson 法評價大鼠神經(jīng)功能受損情況。手術(shù)后神經(jīng)功能評分為1、2、3 分的大鼠納入后續(xù)實驗，評分為0 分、4 分不納入。MCAO造模后大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，將病情穩(wěn)定的大鼠納入后期制備實驗卒中后抑郁大鼠，納入總數(shù)為30 只。

1.3 制備PSD 大鼠模型與分組 經(jīng)過卒中模型制備術(shù)后入組的大鼠進(jìn)行每天單籠孤養(yǎng)及2h 束縛。束縛以大鼠不能轉(zhuǎn)側(cè)為標(biāo)準(zhǔn)，束縛時間從13 ∶00 至15 ∶00，連續(xù)21d。隨機(jī)分為PSD+生理鹽水（NS）組，PSD+氟西?。‵lx）組，PSD+DISS 組，以及正常組（CC 組），每組各10 只。

1.4 試劑準(zhǔn)備及給藥 DISS 純度99.06%（HPLC）（成都曼斯特生物科技有限公司研制，批號：MUST-16070608）。鹽酸氟西汀分散片（20mg×28 片/盒，批號：160622，廠家：PATHEON FRANCE）。10%水合氯醛（杭州昊天生物科技有限公司），9%生理鹽水（杭州民生藥業(yè)有限公司），給藥周期為21d，從束縛第1天開始，束縛前30min，PSD+DISS 組予DISS 稀釋液，給藥量為4.7g/（kg·d）（按人體用藥量換算成大鼠等效劑量），PSD+FLX 組予氟西汀藥液灌服1 次，用量為1.8mg/（kg·d），正常組和PSD+NS 組則灌服等量生理鹽水6.7ml/（kg·d）。

1.5 行為學(xué)實驗 （1）體質(zhì)量監(jiān)測：稱量各組大鼠在制備PSD 模型前、孤養(yǎng)束縛第7、14、21 天的體質(zhì)量，并記錄。（2）糖水偏好實驗：于孤養(yǎng)束縛后第7、14、21 天進(jìn)行糖水偏好試驗，在第6 天對大鼠進(jìn)行糖水適應(yīng)飲用訓(xùn)練，即將2 瓶均為1%糖水在第1 個24h 內(nèi)置于每個鼠籠，隨后在第2 個24h 內(nèi)將1 個水瓶換為純凈水，另1 個瓶仍為1%糖水；大鼠禁食禁水21h后開始實驗，1 瓶1%糖水和1 瓶純凈水分別放置在每個測試鼠籠前，1h 后互換2 個水瓶位置，再過1h 后取瓶，測量并計算動物的糖水偏好程度。糖水偏好程度=糖水消耗量/總液體消耗量。

1.6 神經(jīng)遞質(zhì)水平測定 具體操作方法按試劑盒使用說明書操作。該試劑盒采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組間多重比較行LSD 檢驗。大鼠建模前體質(zhì)量采用單因素方差分析，建模后體質(zhì)量變化及糖水偏好程度用重復(fù)測量方差分析；對單胺遞質(zhì)分析采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 PSD 模型建立前各組實驗大鼠體質(zhì)量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；各組大鼠4 個時間點體質(zhì)量重復(fù)測量方差分析顯示，組間 效 應(yīng)F=31.066，P＜0.001；時 間 效 應(yīng)F=75.465，P＜0.001；時間組別交互效應(yīng)F=13.881，P＜0.001。各組大鼠體質(zhì)量隨時間變化上升，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，時間和組間存在交互效應(yīng)。各組大鼠4 個時間點體質(zhì)量兩兩分析顯示：CC 組體質(zhì)量大于其余各組；PSD+NS 組體質(zhì)量小于其余各組；PSD+DISS組體質(zhì)量小于PSD+FLX 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量改變比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量改變比較（±s）

注：F組間=31.066，P＜0.001；F時間=75.465，P＜0.001；F交互=13.881，P＜0.001

組別 建模前 束縛第7天 束縛第14天 束縛第21天PSD+DISS組 245.00±5.77 256.25±27.80 236.75±30.30 259.00±30.13 PSD+FLX組 253.83±8.40 248.50±11.59 267.67±11.67 296.67±14.69 PSD+NS組 243.00±16.99 223.75±17.39 226.50±22.93 239.00±17.17 CC組 247.83±5.12 270.17±9.32 345.33±10.89 375.83±11.60

2.2 各組大鼠糖水偏好程度比較 各組大鼠3 個時間點糖水偏好程度重復(fù)測量方差分析顯示，組間效應(yīng)F=65.232，P＜0.001；時間效應(yīng)F=1.580，P=0.220；時間組別交互效應(yīng)F=3.409，P=0.004。各組大鼠3 個時間點糖水偏好兩兩分析顯示：CC 組糖水偏好高于PSD+FLX 組及PDS+NS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；PSD+NS組糖水偏好第14、21 天低于其余各組，差異有統(tǒng)計意義；PSD+DISS 組糖水偏好均高于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠糖水偏好程度結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠糖水偏好程度結(jié)果比較（±s）

注：F組間=65.232，P＜0.001；F時間=1.580，P=0.220；F交互=3.409，P=0.004

組別 束縛第7天 束縛第14天 束縛第21天PSD+FLX組 0.71±0.03 0.71±0.05 0.72±0.02 PSD+DISS組 0.97±0.03 0.96±0.03 0.97±0.01 PSD+NS組 0.72±0.02 0.69±0.07 0.58±0.07 CC組 0.85±0.07 0.78±0.09 0.83±0.03

2.3 各 組5-HT、DA、NE 水 平 比 較 在5-HT 和DA 水平測定中，與CC 組比較，除PSD+FLX 組外，其余PSD 組均較低（P＜0.05）；與PSD+NS 組比較，PSD+DISS、PSD+FLX 組5-HT 和DA 水平較高（P＜0.05）。在NE 水平上，PSD+FLX 組高于CC 組（P＜0.05），其余PSD 組均低于CC 組（P＜0.05），且NS 組最低；與NS 組比較，其余兩個PSD 組均較高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組5-HT、DA、NE水平比較（±s）

表3 各組5-HT、DA、NE水平比較（±s）

注:與CC組比較，▲P＜0.05；與PSD+NS組比較，*P＜0.05；與PSD+FLX組比較，#P＜0.05

分組 5-HT DA NE PSD+NS組 32.33±5.40▲ 444.15±71.25▲ 41.75±6.75▲PSD+FLX組 56.56±3.45* 867.80±59.36* 68.20±4.17▲*PSD+DISS組 39.02±2.02▲*# 629.59±57.22▲*# 51.77±4.09▲*#CC組 52.89±4.01 868.55±57.78 64.81±2.83

3 討論

PSD 是腦卒中最常見的并發(fā)癥之一，在我國腦卒中患者的發(fā)病率＞40%［10］，其臨床可表現(xiàn)為情緒低落、興趣喪失、思維遲緩等。PSD 患者病死率較單純腦卒中患者高3～4 倍，因此臨床將PSD 視為預(yù)防二次腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。PSD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)解剖學(xué)、社會心理學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)等諸多因素。目前多項發(fā)病機(jī)制均涉及5-HT、NE、DA 等單胺遞質(zhì)的變化，如生物學(xué)機(jī)制認(rèn)為腦卒中患者腦部血流量的異常損傷額葉與邊緣系統(tǒng)，破壞額葉-紋狀體-蒼白球-丘腦皮質(zhì)環(huán)路，造成5-HT 和NE 等神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常，從而導(dǎo)致PSD 的發(fā)生。從單胺能遞質(zhì)角度進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，缺血性病變可能阻斷來自中腦和腦干的投射，致使5-HT、NE 和DA 下降，導(dǎo)致PSD的發(fā)生［11］。

本實驗中，以MACO 及孤養(yǎng)束縛進(jìn)行造模。劉福友等通過此造模及行為學(xué)評價、單胺遞質(zhì)的測定證實本實驗復(fù)合制備的腦卒中后抑郁大鼠模型思路可行，造模是成功的［12］。通過查閱文獻(xiàn)也發(fā)現(xiàn)，MACO 聯(lián)合孤養(yǎng)束縛是應(yīng)用廣泛的造模方法，且造模確切、成功。

遠(yuǎn)志被用于鎮(zhèn)靜、緩解精神不安和提高學(xué)習(xí)與記憶能力［13］，DISS 作為遠(yuǎn)志的主要活性成分，在以往研究中發(fā)現(xiàn)，其在抗抑郁作用中起重要作用。施振國等［14］認(rèn)為，DISS 的抗抑郁機(jī)制可能是通過神經(jīng)元保護(hù)和神經(jīng)元再生實現(xiàn)的。趙潤清［15］認(rèn)為DISS 參與啟動CREB 共轉(zhuǎn)錄因子CRTC1，激活海馬內(nèi)CREB 的磷酸化，進(jìn)而增加其下游BDNF 表達(dá)，發(fā)揮抗抑郁作用。陳旭［16］認(rèn)為DISS 可以激活CREB 磷酸化的上游通路和鈣調(diào)蛋白激酶上的關(guān)鍵靶點CaMK 和 ERK，促進(jìn)CREB 磷酸化過程，并進(jìn)一步通過激活磷酸化CREB，與基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)的特殊組件結(jié)合刺激mRNA 的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)下游靶基因bax、bcl-2 并調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等細(xì)胞因子的水平，通過這些細(xì)胞因子進(jìn)一步影響神經(jīng)可塑性神經(jīng)分化、神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)聯(lián)系及信號整合發(fā)揮抗抑郁作用。

本資料結(jié)果顯示，模型組PSD+NS 組大鼠較CC組大鼠體質(zhì)量減輕、糖水偏好程度下降，單胺遞質(zhì)濃度降低，提示模擬出PSD 患者體質(zhì)量下降、興趣感減退和腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)降低等表現(xiàn)，表明造模成功。治療組單胺遞質(zhì)水平結(jié)果均優(yōu)于PSD+NS 組，表明FLX及DISS 的治療在一定程度上是有效的。PSD+DISS 組明顯優(yōu)于PSD+FLX 組，且在實驗全過程均保持較高水平；但在體質(zhì)量及單胺遞質(zhì)水平方面，雖然PSD+DISS組優(yōu)于PSD+NS 組，但仍低于PSD+FLX 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，DISS 對PSD 的改善可能通過提高5-HT、DA、NA 濃度水平發(fā)揮作用，然而，本研究僅基于行為學(xué)實驗及單胺類遞質(zhì)濃度水平的測定對DISS的作用進(jìn)行初探，其上游機(jī)制仍未明確，后期可進(jìn)一步對上游通路CaMK Ⅱ-Cx43 信號通路的可能性作進(jìn)一步深入研究以揭示藥物作用靶點，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。