尹國(guó)麗,李亞娟,張振粉,李小龍,張曉燕,師尚禮,*

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院, 蘭州 730070 2 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070

以紫花苜蓿(MedicagosativaL.)為代表的多年生豆科牧草是我國(guó)主要種植加工的一大類飼草作物,在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中有著不可或缺的作用,但是連作障礙一直是多年生牧草種植的瓶頸問(wèn)題。近些年已有大量學(xué)者進(jìn)行了探索,證實(shí)連作障礙的發(fā)生不僅與土壤理化性質(zhì)改變有關(guān),還與土壤微生物組成有關(guān)[1-2],土壤微生物作為土壤中的活性因子,是反應(yīng)土壤質(zhì)量最敏感的指標(biāo),近年來(lái)已有大量的研究表明在土壤微生物與連作障礙之間存在密切關(guān)系[3-4]。

草田輪作是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中消減連作障礙最廣泛的應(yīng)用措施,輪作通過(guò)增加作物組分豐富了地上、地下生物多樣性,改變了土壤微生態(tài)環(huán)境[5],大量試驗(yàn)證明,輪作不僅可以協(xié)調(diào)不同作物之間養(yǎng)分吸收的局限性,避免養(yǎng)分失衡,提高土壤養(yǎng)分的有效性和酶活性,還可以通過(guò)根系分泌物調(diào)整根圍微生物群落組成,減少土傳病蟲(chóng)害的發(fā)生,提高經(jīng)濟(jì)效益[6-7],但不同輪作模式對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響不盡相同。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分,其群落結(jié)構(gòu)和多樣性主要受植物物種組成和土壤養(yǎng)分狀況的影響[8],不同作物釋放的根系分泌物存在差別,也影響了土壤微生物群落生長(zhǎng)代謝和群落結(jié)構(gòu)[9-11]。細(xì)菌是土壤微生物中分布最廣,數(shù)量最多的部分[12],占土壤微生物總數(shù)的70%—90%,是土壤養(yǎng)分變化的敏感指標(biāo)之一[13]。研究微生物群落組成及多樣性一直是揭示植物-微生物互作關(guān)系機(jī)制的熱點(diǎn)問(wèn)題[14-15]。目前高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,提高了研究者對(duì)環(huán)境中微生物群落組成和功能的認(rèn)知水平[16-17]。

科學(xué)合理的輪作模式可有效緩解連作障礙引起的土壤環(huán)境惡化,使土壤中微生物活性增強(qiáng)、多樣性增加,為作物生長(zhǎng)提供健康穩(wěn)定的土壤生態(tài)環(huán)境[18-19]。目前關(guān)于紫花苜蓿草田輪作的研究報(bào)道相對(duì)較多,但前人的研究多集中在輪作對(duì)作物田土壤肥力及產(chǎn)量的影響[20-22],缺乏紫花苜蓿-作物輪作系統(tǒng)中土壤細(xì)菌組成方面的研究報(bào)道。鑒于此,本試驗(yàn)分析5齡紫花苜蓿草地和不同作物輪作模式下,土壤養(yǎng)分因子含量和土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成及其相互關(guān)系,旨在較深層次上探索紫花苜蓿連作障礙的形成機(jī)制,為采用輪作措施減輕紫花苜蓿連作障礙提供實(shí)踐依據(jù),并為半干旱地區(qū)草田輪作和草地生態(tài)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于在甘肅省武威市涼州區(qū)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)黃羊鎮(zhèn)牧草站(103°5′E,37°30′N,海拔1776 m)。位于甘肅河西走廊東端,屬冷溫帶干旱區(qū),典型的大陸性氣候,日照充足,春季多風(fēng)沙,夏季有干熱風(fēng)。降水年際變化不大,但季節(jié)變化較大,多年平均降水量160 mm左右,主要集中在7、8、9月份,冬春季干旱,降水無(wú)法滿足作物生長(zhǎng)的需要。年蒸發(fā)量2400 mm,年平均氣溫7.2 ℃,一月最低氣溫 -27.7 ℃,七月最高氣溫34.0 ℃,0 ℃積溫3513.4 ℃,10 ℃積溫2985.4 ℃。全年無(wú)霜期156 d,絕對(duì)無(wú)霜期118 d,年日照時(shí)數(shù)2945 h。土壤以荒漠灌淤土為主,粉沙壤質(zhì),土層深厚。

1.2 供試材料

供試材料小麥品種為雜交種春寧4號(hào)(TriticumaestivumL.cv.Chunning No.4),玉米品種為雜交種隴單4號(hào)(ZeamaysL.cv.Longdan No.4),紫花苜蓿品種為甘農(nóng)3號(hào)(MedicagosativaL.cv.Gannong No.3)。小麥及玉米種子市售,紫花苜蓿種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取地勢(shì)平坦的紫花苜蓿草地進(jìn)行草田輪作試驗(yàn)。設(shè)計(jì)如表1所示,設(shè)4個(gè)處理。試驗(yàn)小區(qū)面積為4 m×5 m,不同小區(qū)間設(shè)1 m隔離帶,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),不同小區(qū)的土壤肥力及管理方式相同。

表1 紫花苜蓿-玉米/小麥不同輪作處理

1.4 土樣采集

于2017年7月中旬采集土壤樣品,五點(diǎn)法取樣,用內(nèi)徑40 mm的土壤取樣器取0—30 cm土層(耕作層)土樣。每次采集后用70%的酒精對(duì)土壤采樣器進(jìn)行消毒處理,以避免不同樣品之間的污染。采得土樣去除植物殘?bào)w和石礫等雜物后放入滅菌袋,低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室,盡快進(jìn)行土壤DNA的提取和其余操作。

1.4.1土壤養(yǎng)分測(cè)定

土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀法測(cè)定；土壤全氮采用凱氏定氮法測(cè)定；土壤堿解氮采用堿解擴(kuò)散法；土壤全鉀采用火焰光度法；土壤有效鉀含量先用醋酸銨浸提,再用火焰光度法測(cè)定；土壤全磷采用HClO4-H2SO4消煮法；土壤速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鋁銻抗比色法測(cè)定[23]。

1.4.2土壤微生物DNA提取和 16S rRNA 基因高通量測(cè)序

將采集的樣品揀除雜質(zhì)后,同一樣品充分混合使之均勻,準(zhǔn)確稱取1.00 g新鮮土樣。采用OMEGA土壤DNA提取試劑盒提取土壤總DNA,提取步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。1%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度法檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量和濃度,檢測(cè)合格后利用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物314F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG- 3′)

- 805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC- 3′)擴(kuò)增土壤微生物16S rRNA V3+V4區(qū)基因片段。PCR反應(yīng)體系如下：Phusion Master Mix(1X)15 μL,DNA模版(1 ng/μL)10 μL,正、反向引物(0.2 μmol/L) 各3 μL,ddH2O補(bǔ)至30 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：95℃,3 min；(95 ℃,30 s； 55℃,30 s；72 ℃,30 s),25個(gè)循環(huán)；16 ℃10 min[24]。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果,檢測(cè)合格后送交至上海生工生物科技公司進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)和高通量測(cè)序。

1.5 序列分析

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖；用SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用最小顯著差異法(LSD)比較數(shù)據(jù)組間的差異,用Person相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)不同因子間的相關(guān)性。用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件完成相關(guān)關(guān)系分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同輪作模式對(duì)土壤養(yǎng)分的影響

如表2所示,紫花苜蓿輪作作物1年時(shí),A5C1處理的有機(jī)質(zhì)含量為12.3 g/kg,A5W1處理為11.85 g/kg,輪作第2年,無(wú)論后茬作物是玉米還是小麥,有機(jī)質(zhì)含量較輪作第1年均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),輪作玉米處理第2年比第1年下降3.66%,而小麥處理下降了7.68%。其余指標(biāo)均呈現(xiàn)出相似的規(guī)律,就玉米輪作組而言,第2年與第1年相比,全氮下降了2.17%,全磷下降了9.28%,全鉀、堿解氮、速效磷、速效鉀呈現(xiàn)不同程度的下降,其中,下降幅度最大的是速效磷,下降了25.8%,下降幅度最小的是堿解氮,下降了0.47%。輪作小麥和輪作玉米表現(xiàn)出了相似的規(guī)律,都是輪作第2年各指標(biāo)較第1年下降,下降幅度最大的是速效磷,下降了38.37%,下降幅度最小的是速效鉀,為2.53%。

表2 不同輪作模式下的土壤養(yǎng)分含量

同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.2 不同輪作模式下土壤測(cè)序結(jié)果及深度

測(cè)序得到的土壤細(xì)菌群落序列讀數(shù)和OTUS數(shù)(表3),在相似度大于97%的水平上4個(gè)輪作模式共獲得高質(zhì)量目標(biāo)序列42743條。Clean Reads Rate值均高于80%,說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量可以反映土壤細(xì)菌群落組成情況。不同輪作模式統(tǒng)計(jì)分析表明,土壤細(xì)菌OTUS種類數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 不同輪作模式下土壤細(xì)菌序列讀數(shù)及OTUS數(shù)

大寫(xiě)字母表示同行之間比較, 小寫(xiě)字母同列之間比較, 不同字母在 0.05 水平下差異顯著

2.3 不同輪作模式對(duì)土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性的影響

由表4所示,除ACE指數(shù)外,其余3個(gè)指數(shù)都呈現(xiàn)出A5C2>A5W1>A5W2>A5C1的趨勢(shì),ACE指數(shù)雖為A5W2>A5W1,但差異不顯著。綜上,不同指數(shù)反映出了基本一致的趨勢(shì)。

表4 不同輪作模式下土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性比較

2.4 不同輪作模式對(duì)土壤細(xì)菌組成的影響

在門水平上,除極少部分細(xì)菌(0.02%—0.05%)未被分類外,4種輪作模式下土壤細(xì)菌主要分布在23個(gè)細(xì)菌門類。由圖1可知,優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(Proteobacteria)(25.30%—41.90%)和放線菌門(Actinobacteria)(14.50%—19.80%)以及厚壁菌門(Firmicutes)(3.70%—23.70%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(5.40%—13.90%)。其次,擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的豐度也相對(duì)較高,其余菌門在各處理中均有分布,相對(duì)豐度因處理不同而存在差異,但差異不顯著(P>0.05)。另外,優(yōu)勢(shì)菌在不同輪作模式下的組成也不同,A5W2中變形菌門(Proteobacteria)含量很高,而厚壁菌門(Firmicutes)含量卻較低,而這兩種菌在其他輪作模式下含量較為穩(wěn)定。

圖1 不同輪作模式土壤在門水平上的細(xì)菌類群比較Fig.1 Comparison of bacteria groups at phylum level in the soils under different rotation sequencesA5W1: 5a紫花苜蓿- 1a小麥;5a紫花苜蓿- 2a小麥;A5C1: 5a紫花苜蓿- 1a玉米；A5C2: 5a紫花苜蓿- 2a玉米

圖2 不同輪作模式土壤在屬水平上的細(xì)菌類群比較Fig.2 Comparison of bacterial groups in the soils at the genus level under different rotation patterns

在屬的分類水平,除未被分類的細(xì)菌屬外(41.31%—53.78%),各輪作模式土壤細(xì)菌相對(duì)豐度排序前13的細(xì)菌菌屬分布見(jiàn)圖2。不同輪作模式下土壤優(yōu)勢(shì)屬基本相同,其中丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)以及奈瑟氏球菌屬(Neisseria)為優(yōu)勢(shì)屬。但不同輪作模式下土壤各細(xì)菌屬所占相對(duì)豐度大小存在差異,如芽孢桿菌屬(Bacillus)在A5W1中相對(duì)豐度最高,但在A5W2中卻相對(duì)較低。

2.5 不同輪作模式下土壤細(xì)菌屬相對(duì)豐度的主成分分析

圖3 不同輪作模式土壤在屬水平細(xì)菌相對(duì)豐度主成分分析 Fig.3 Principal component analysis of relative abundance of soil bacteria at genus level under different rotation patternss

由圖3可知,4種輪作模式下土壤細(xì)菌物種相對(duì)豐度共提取4個(gè)主成分,累積貢獻(xiàn)率達(dá)96.82%,其中第1主成分(PC1) 和第2主成分(PC2)貢獻(xiàn)率分別為68.25%和22.32%。從圖3中可以看出4種輪作模式中A5W1和A5C1分布在PC1軸負(fù)方向,A5W2和A5C2分布在正方向。A5W1和A5C2序列分布在PC2軸正方向,A5C1和A5W2分布在負(fù)方向。

載荷因子反映主成分與細(xì)菌屬水平豐度的相關(guān)系數(shù),載荷因子越高,表示該細(xì)菌屬對(duì)主成分的影響越大[12]。由表5可知,與第一主成分(PC1)具有較高相關(guān)性的細(xì)菌屬主要有固氮菌屬Azotobacter、硝化螺旋菌屬Nitrospira、小梨形菌屬Pirellula、Iamia菌屬和芽孢桿菌屬Bacillus,與第二主成分(PC2)具有較高相關(guān)性的細(xì)菌屬則主要有Flavisolibacter菌屬、德沃斯氏菌屬Devosia、德沃斯氏菌屬、拜納蒙納斯屬Balneimonas、Adhaeribacter菌屬(表5)。

表5 屬水平豐度的主成分載荷因子

表中帶的為兩個(gè)主成分中相關(guān)性前5的細(xì)菌屬

2.6 基于土壤細(xì)菌組成的不同輪作模式聚類分析

由圖4可見(jiàn),在屬水平上,A5W1和A5C1的組成最接近,其次是A5C2,A5W2的組成與前兩者相差較大,說(shuō)明作物輪作的時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)菌組成差異越大。

圖4 不同輪作模式土壤在屬水平細(xì)菌組成聚類分析 Fig.4 Cluster analysis of genus level composition of soil bacteria under different rotation patterns

2.7 土壤養(yǎng)分與土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬間的相關(guān)關(guān)系

由表6可知,土壤養(yǎng)分因子與各細(xì)菌屬的相關(guān)性不同,有機(jī)質(zhì)與丙酸桿菌屬Propionibacterium及固氮菌屬Azotobacter呈現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05),而與芽孢桿菌屬Bacillus為極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。全鉀與鏈球菌屬Streptococcus呈現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05),土壤堿解氮與丙酸桿菌屬Propionibacterium呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),與固氮菌屬Azotobacter呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；而速效磷與丙酸桿菌屬Propionibacterium、芽孢桿菌屬Bacillus及固氮菌屬Azotobacter均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

3 討論

3.1 輪作模式和土壤細(xì)菌多樣性

土壤細(xì)菌作為土壤中最重要的活性組分,其多樣性水平也是反映土壤環(huán)境的最重要指標(biāo)。通過(guò)本研究結(jié)果可以看出,后茬作物種類和輪作時(shí)間對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)都有明顯的影響。其他學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律,如王芳等[25]利用Illumina Mi Seq技術(shù)對(duì)不同連作及輪作方式下大豆根際細(xì)菌進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)連作時(shí)間、輪作作物種類和輪作順序3個(gè)因素對(duì)對(duì)土壤細(xì)菌多樣性都會(huì)產(chǎn)生影響。梁志婷[26]在甘肅隴東地區(qū)進(jìn)行了不同糧草輪作模式對(duì)土壤微生物多樣的研究結(jié)果也與本研究相似。本研究的結(jié)果顯示,輪作作物和輪作時(shí)間2個(gè)因子對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響是普遍的,不同作物上的研究均支持這一結(jié)論。因此,在利用輪作改善土壤微生態(tài)時(shí),應(yīng)充分考慮2個(gè)因子,使其發(fā)揮最佳效果。另一方面,本研究也提出了新的科學(xué)問(wèn)題,即在輪作體系中,作物種類和輪作時(shí)間這2個(gè)因子,哪一個(gè)對(duì)土壤微生物多樣性的組成影響更大,這將是值得深入研究的新課題。

表6 不同養(yǎng)分因子和幾種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬之間的相關(guān)性分析

*P<0.05；**P<0.01

3.2 不同輪作模式下土壤細(xì)菌群落組成

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受種植作物的影響[27],作物種類不同其土壤微生物所處環(huán)境不同,細(xì)菌組成和豐度大小有差異,不同的農(nóng)田土壤中存在共有和特異的細(xì)菌種群[28]。本研究發(fā)現(xiàn)變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)以及厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)為各輪作順序豐度較高的菌,這一結(jié)果與Sapp等[29]、Liu等[30]和王伏偉等[31]對(duì)土壤細(xì)菌的研究結(jié)果一致。在屬的水平,芽孢桿菌屬(Bacillus)在耕層豐度較高,該屬為不產(chǎn)氧光合細(xì)菌,其功能與禾本科作物聯(lián)合固氮作用緊密相關(guān)[32],這與4個(gè)輪作順序取樣階段均為禾本科作物相符。研究表明,某些植物能夠與土壤微生物產(chǎn)生互作作用,對(duì)植物病害控制產(chǎn)生一定效果,同時(shí)也可能會(huì)引起某種作物感染病害[33]。本研究發(fā)現(xiàn),5a紫花苜蓿- 1a玉米序列土壤中芽孢桿菌屬(Bacillus)和奈瑟氏球菌屬(Neisseria)豐度較高,該菌屬能夠通過(guò)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶或細(xì)菌素的方式對(duì)土壤線蟲(chóng)發(fā)育產(chǎn)生抑制作用,有生防效果[34-35]。研究結(jié)果在揭示在河西走廊灌區(qū)連作苜蓿后輪作禾本科作物在改善土壤肥力的同時(shí),對(duì)胞土壤害蟲(chóng)防治效果較好。輪作后Fimbriimonas菌屬豐度較高,此菌具有固氮和脫氮特征,在維持氮平衡方面起重要作用[36]。

3.3 輪作時(shí)間與土壤細(xì)菌群落

細(xì)菌群落是土壤微生物中最主要的一類微生物,是土壤微生物多樣性的重要指標(biāo)。應(yīng)用高通量測(cè)序分析技術(shù),可以比較準(zhǔn)確地反映細(xì)菌群落特征[37- 38]。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)比研究了不同輪作模式下土壤細(xì)菌多樣性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同的輪作模式下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的差異。但是主要優(yōu)勢(shì)菌群保持穩(wěn)定,都以變形菌門(Proteobacteria)豐度最高,土壤中每一特定性的菌類均具有不同的功能特性,變形菌是一類適應(yīng)性很強(qiáng)的細(xì)菌,該類菌中即包含動(dòng)植物的病原菌也存在抑制致病菌的有益菌[39- 40],但是不同輪作模式的細(xì)菌組成也有不同,輪作1年的比輪作2年的芽單胞菌門的豐度要高。芽單胞菌類是有益于作物生長(zhǎng)的細(xì)菌,輪作1年時(shí),該類菌群數(shù)量明顯高于第2年,這可以從土壤微生物特定菌類的增加來(lái)解釋輪作栽培有益于作物生物生長(zhǎng)。輪作栽培由于不同的作物對(duì)養(yǎng)分和水分吸收以及根系分泌物不同,因而能夠改變土壤微生物的生態(tài)環(huán)境。吳宏亮對(duì)砂田土壤進(jìn)行輪作栽培研究,發(fā)現(xiàn)輪作改變砂田土壤微生物區(qū)系結(jié)構(gòu),提高微生物多樣性[41]。本研究中,無(wú)論后茬作物玉米還是小麥,輪作2年實(shí)際上又造成了禾本科作物的連作,因此,其土壤微生態(tài)的組成要劣于輪作1年的。

4 結(jié)論

在多年種植苜蓿地和不同禾本科作物復(fù)種輪作模式下,不同輪作模式對(duì)土壤養(yǎng)分各指標(biāo)有不同程度的影響,后茬作物無(wú)論是玉米還是小麥,輪組第2年土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷和速效鉀的含量都較第1年有明顯的下降。4種輪作模式下占優(yōu)勢(shì)的菌門為變形菌門、放線菌門和厚壁菌門。土壤細(xì)菌群落屬組成中以丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)以及奈瑟氏球菌屬(Neisseria)為優(yōu)勢(shì)屬等為主。土壤細(xì)菌多樣性以A5C2輪作模式下最高,A5C1最低；聚類分析顯示A5W1和A5C1的組成最接近,其次是A5C2,A5W2的組成與前兩者相差較大。土壤養(yǎng)分因子含量與幾種優(yōu)勢(shì)屬呈現(xiàn)了不同程度的相關(guān)性。研究結(jié)果揭示了河西走廊灌溉區(qū)種植多年紫花苜蓿后復(fù)種小麥和玉米改善土壤肥力和防治某些土傳植物病害微生物的機(jī)理。