周海倫 , 蔣延波 , 唐禮

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院；廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究重點實驗室；廣西頜面外科疾病診治研究重點實驗室；廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 南寧）

0 引言

口腔種植修復(fù)因其具有固位良好、鄰牙損傷小等優(yōu)點成為牙列缺失、缺損修復(fù)的主要手段。然而，種植體周圍炎是造成種植修復(fù)失敗最常見的原因。種植體周圍炎指發(fā)生在種植體周圍軟、硬組織以菌斑生物膜為始動因素的感染性疾病，被認(rèn)為是細(xì)菌挑戰(zhàn)與宿主反應(yīng)不平衡的結(jié)果。種植體周圍炎是目前研究熱點，但其病因和發(fā)病機制尚未明確。 近期wu等一項基于芯片技術(shù)犬種植體周圍炎軟組織基因表達(dá)譜，揭示部分犬種植體周圍炎差異基因在種植體周圍炎的表達(dá)和作用。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing,RNA-Seq）是近年來開發(fā)的一種利用高通量深度測序技術(shù)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組分析方法。RNA-seq它已廣泛應(yīng)用于癌癥研究、發(fā)育生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)。然而，在口腔疾病中的研究仍較少。據(jù)我們所知，較基因芯片技術(shù)，本次實驗首次應(yīng)用第二代測序技術(shù)用于人種PI全轉(zhuǎn)錄組的研究。WGCNA的目的是找到用于共表達(dá)的基因模塊，并探索基因網(wǎng)絡(luò)與目標(biāo)表型之間的關(guān)系以及網(wǎng)絡(luò)中的中樞基因。在本研究中，我們收集了PI患者和HI個體的牙齦組織，使用第二代高通量RNA測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。接下來，我們選擇關(guān)鍵模塊以通過Hallmarks基因集富集分析和PI中相關(guān)途徑成員的表達(dá)分析來揭示關(guān)鍵的生物學(xué)過程或信號傳導(dǎo)途徑。在這項研究中，我們希望可以使用高通量測序技術(shù)來分析困擾PI研究的核心問題。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采集2017年12月至2018年12月就診于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院PI及HI人的牙齦組織標(biāo)本。PI診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]如下：（1）輕探有出血或化膿。（2）探診深度≥6 mm。（3）咬合負(fù)重功能一年后，由于初始骨重塑或進(jìn)行性骨吸收導(dǎo)致的骨吸收水平變化≥2 mm。根據(jù)既定方案，在治療PI外科手術(shù)清創(chuàng)過程中移除種植體周圍發(fā)炎的軟組織。健康牙齦：無臨床感染患者的牙齦組織作為對照組。這些患者均采用智齒切除術(shù)或正畸需要切除的牙齒進(jìn)行手術(shù)。

18歲及以上未吸煙和飲酒的患者均排除在全身性疾病和其他口腔疾病之外，如常見粘膜疾病、腫瘤等。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會（2017-165號）批準(zhǔn)。所有患者同意參與研究，并在手術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 RNA 測序

在Hiseq 2500儀器上進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組RNA深度測序，由Illumina（圣地亞哥，加利福尼亞州，美國）提供的說明書指示建立文庫。

1.3 RNA 序列數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因分析

RNA測序數(shù)據(jù)使用Galaxy工具進(jìn)行分析。利用EdgeR軟件包進(jìn)行差異基因分析。其中，P＜0.05和log2fc（FC）≥2的mRNAs被認(rèn)為是差異表達(dá)基因（DEGs），并利用R軟件包完成了upset維恩圖、火山圖和差異基因熱圖。

1.4 建立加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，重要模塊的功能富集分析

利用R語言進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。包括三個步驟：計算基因之間的相關(guān)系數(shù)，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)以及確定具有特征和功能的基因模塊。此外，我們還計算了模塊中每個基因的度（degree）與其 - log10（P值）之間的關(guān)系。篩選出明顯富集的基因模塊。以Hallmarks基因集為來源，利用基因富集分析揭示關(guān)鍵基因模塊的關(guān)鍵生物學(xué)過程或信號通路。取P＜0.01、最小計數(shù)為3、富集系數(shù)>1.5的項目，并根據(jù)它們的成員相似性將其分組。使用Metascape工具進(jìn)行功能富集分析及可視化。

2 結(jié)果

2.1 RNA 定量與差異表達(dá)基因分析

本研究檢測5例種HI牙齦樣本中RNAs的表達(dá)水平，并以5例HI作為對照。EdgeR將所有基因count數(shù)歸一化為M-值的加權(quán)截尾均值（TMM）。結(jié)果顯示，與HI組相比，PI組有172個顯著上調(diào)的mRNAs和5064個顯著下調(diào)的mRNAs。

圖1A為差異基因表達(dá)火山圖，從 -log10 P value and log2 (fold change, FC) 兩個維度上所有顯著不同表達(dá)的mRNAs的分布。前10個差異基因列表如表1所示。

圖1 A 差異基因火山圖（注：紅色點表示相對于對照樣本表達(dá)量上調(diào)基因，綠色點為下調(diào)基因，黑色點為無顯著差異基因。）

表 1 PI-vs-HI 前10 個差異基因列表

2.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

如圖2所示，可見基因被分配到11個模塊用于功能和模塊相關(guān)性分析。根據(jù)每個模塊的特征基因，計算這些模塊與每個性狀之間的相關(guān)性。

2.3 關(guān)鍵基因模塊的信號通路分析與基因表達(dá)分析

kME被用來評估Hub基因之間有效連接性和識別模塊成員。選擇kME>0.7作為模塊的成員，也被稱為Hub基因，能更好地代表整個模塊的表達(dá)趨勢。根據(jù)模塊與性狀和功能的相關(guān)分析結(jié)果。每個基因的度k和-log10（p）之間的相關(guān)性被加權(quán)，加權(quán)結(jié)果顯示這三個模塊紫色、綠色、紅色（kMEpurple、kMEgreen、kMEred）中的基因與HI的發(fā)病機制顯著相關(guān)（P＜0.05，圖3A）。

通過Hallmarks基因集基因富集分析揭示關(guān)鍵基因模塊的關(guān)鍵生物學(xué)過程或信號傳導(dǎo)途徑。如圖3B所示，在紫色模塊中，Hub基因主要富集在IL2-STAT5信號通路、NF-κB/TNFα 信號通路和血管生成信號通路上。在kME綠色模塊中，Hub基因主要富集在Hedgehog信號通路、Wnt β-Catenin信號通路和IL2-STAT5信號通路上。在紅色模塊中，Hub基因主要富集在過氧化物酶生成、IL2 STAT5信號通路和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中。

圖3 A）紫、綠、紅模塊的基因顯著性，橫軸代表模塊，縱軸代表模塊的顯著性。B）對應(yīng)三個模塊基因成員的富集分析情況

3 討論

本研究采用第二代高通量測序技術(shù)對種植體周圍炎軟組織病變進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析。為了分析基因表達(dá)譜的動態(tài)變化，建立了WGCNA，以探索基因網(wǎng)絡(luò)與表型之間的關(guān)系。WGCNA可以避免現(xiàn)有生物學(xué)方法的廣泛假陽性和假陰性結(jié)果，并排除差異基因分析中不合理的統(tǒng)計過濾。在這項研究中，我們首先使用WGCNA揭示PI機制，發(fā)現(xiàn)三個重要功能模塊，隨后對其Hub基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)IL2-STAT5、Wntβ-Catenin信號通路、NF-κB/TNFα 信號通路、Hedgehog信號通路、過氧化物酶生成與PI發(fā)病機制密切相關(guān)。

三個關(guān)鍵模塊的富集結(jié)果均包含IL2 STAT5信號傳導(dǎo)途徑，表明IL2介導(dǎo)的免疫細(xì)胞活化在種植體周圍炎中起關(guān)鍵作用。目前IL-2與種植體周圍炎的研究較少。研究發(fā)現(xiàn)IL-2受體依賴性核轉(zhuǎn)錄因子STAT5在激活Treg細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，而Treg細(xì)胞則在體內(nèi)負(fù)調(diào)節(jié)人體的免疫反應(yīng)。作為宿主壓力的重要途徑，由IL2-STAT5信號傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)的Treg細(xì)胞的活化在PI牙齦組織中被活化。在某種程度上，這阻止了炎癥信號的級聯(lián)擴增，并減輕了由炎癥和感染引起的局部組織壞死。然而，這種反應(yīng)也是誘導(dǎo)宿主免疫耐受，引起持續(xù)感染和反復(fù)臨床癥狀的重要途徑。這為我們提供了一些臨床意義：IL 2-STAT5途徑阻滯劑，例如CMD17819或Pimozide20，可能有助于PI治療并在分子水平上抑制Treg細(xì)胞活化。

Wntβ-Catenin信號通路是近年來的研究熱點。在牙周炎中，Wnt信號通路已經(jīng)在包括疾病的發(fā)生、發(fā)展等多個方面被闡明具有重要的作用。已有一些研究表明，Wnt通路可能參與牙齦卟啉單胞菌介導(dǎo)的牙周炎免疫反應(yīng)。而在種植體骨結(jié)合形成的機理研究中，目前研究最多的信號為：Wnt信號通路，其次為BMP信號通路、MAPK信號通路、NF-KB/TFNa。其在包括成骨細(xì)胞等細(xì)胞增殖、成熟過程中起著決定性的作用。本研究中富集結(jié)果相似，提示其與PI的發(fā)病機制密不可分。Hedgehog信號通路在腫瘤、發(fā)育等領(lǐng)域研究較多。在牙種植體周的研究中，主要與骨再生工程有關(guān)，作為眾多成骨因子之中的一員，Sonic hedgehog能夠通過骨形成蛋白及甲狀旁腺激素蛋白等信號通路誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，并在骨再生修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)合本研究結(jié)果，提示Hedgehog信號通路在PI可能通過影響成骨破骨平衡中起到一定的作用。

另外本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵模塊（KMEred）還富集到過氧化物酶生成的生物學(xué)過程。過氧化物酶生成與氧化應(yīng)激有關(guān)。有研究表明，種植體周圍炎患者的齦溝液中氧化應(yīng)激標(biāo)志物升高、唾液中無明顯變化。Chen等人發(fā)現(xiàn)，松動種植體周圍組織中NOX-1和NOX-2的表達(dá)高于對照組。提示種植體周在感染和其他外源性刺激介導(dǎo)的活性氧反應(yīng)在種植體周圍炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

綜上，本研究通過二代高通量技術(shù)對人種植體周圍炎軟組織測序，通過WGCNA生物信息學(xué)分析得到三個關(guān)鍵模塊、對應(yīng)hub基因富集到的七種信號通路/生物學(xué)過程（IL2-STAT5信號通路、NF-κB/TNF、血管生成信號通路、Hedgehog信號通路、Wnt β-Catenin信號通路、過氧化物酶生成、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程）與種植體周圍炎的發(fā)生發(fā)展密不可分，提示其可能作為種植體周圍炎的關(guān)鍵機制，應(yīng)成為今后研究的重點，為進(jìn)一步全面揭示種植體周圍炎機制和治療提供新的思路。