雷升，芮軼群，王娟，竇志芳，任錫祿

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山西 太原）

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性和丟失及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)再生為特征的慢性關(guān)節(jié)炎疾病[1]，是導(dǎo)致人們發(fā)生疼痛、致殘以及增加社會經(jīng)濟(jì)成本的主要疾病之一[2]。據(jù)預(yù)測，2050年我國老年人口將達(dá)到4.8億，幾乎占全球老年人口的25%，是世界上老年人口最多的國家[3]，而世界范圍內(nèi)60歲以上的人群中有10%的男性以及18%的女性受到該病嚴(yán)重的影響[4]。

目前臨床上對于膝骨關(guān)節(jié)炎（Knee Osteoarthritis KOA）的治療多運(yùn)用糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥聯(lián)合玻璃酸鈉的療法進(jìn)行治療[2]，但這些療法大多會產(chǎn)生繼發(fā)性關(guān)節(jié)損害、腎毒性、胃腸道不適等不良反應(yīng)[5-6]。中醫(yī)藥治療本病有顯著療效[7-10],有研究報道，古今眾多醫(yī)家、研究認(rèn)為瘀血與KOA的病因有密切的聯(lián)系[11]；活血化瘀法在臨床上亦多用作本病的關(guān)鍵療法[12—13]。

有研究發(fā)現(xiàn)，用于活血化瘀的經(jīng)典藥對桃仁—紅花藥對（THYD）在臨床上治療KOA的運(yùn)用頻次較高[14—15]。秦氏[16]在實驗中發(fā)現(xiàn)以桃仁、紅花為君藥的桃仁膝康丸可以通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬延緩或阻止外科手術(shù)誘導(dǎo)的大鼠膝關(guān)節(jié)OA 的軟骨退變。因此本研究擬運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法探討THYD治療KOA的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 選取桃紅藥對活性成分

在TCMSP數(shù)據(jù)庫[17](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)上分別搜索桃仁以及紅花的潛在藥效成分。口服生物利用度和類藥性指數(shù)是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)用于篩選有效成分的常用指標(biāo)，口服生物利用度(oralbioavailability, OB)是指制劑中藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度與程度，類藥性指數(shù)(drug like index, DL)是指化合物與已知藥物的相似性。中藥的活性成分必須具有較高的成為藥物的可能性，并且能被人體利用。有研究認(rèn)為，OB>30%符合人體對藥物的利用程度，DL>0.18意味著該成分具有成藥性的可能[18-19]。因此本研究選用上述兩個指標(biāo)對該藥對藥效成分進(jìn)行篩選后選取合適的成分。

1.2 檢索KOA 的相關(guān)靶點(diǎn)

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET（http://www.disgenet.org/search）、OMIM（https://www.omim.org/）等 網(wǎng)站以“Knee Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集所檢索的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 篩選藥物—疾病的共同靶標(biāo)基因

運(yùn)用R語言軟件（Rx64 3.6.0）對“1.1”的結(jié)果和“1.3”結(jié)果進(jìn)行比對與繪制Venn圖。篩選出THYD與KOA的共同靶標(biāo)基因，并用R語言軟件下載Venn圖繪圖軟件使之可視化。

1.4 構(gòu)建活性成分—靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)

采用 Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建“藥效成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)、邊等屬性。其中，節(jié)點(diǎn)代表成分及作用靶點(diǎn)，邊代表成分與靶點(diǎn)相互作用關(guān)系。根據(jù)節(jié)點(diǎn)和邊數(shù)計算成分、靶點(diǎn)相應(yīng)節(jié)點(diǎn)平均度（成分與靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的平均程度），將THYD的藥效成分與KOA作用靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建其藥效成分-靶點(diǎn)—KOA網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建與分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）

把“1.3”中的共同靶標(biāo)基因用 STRING數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）進(jìn)行檢索，設(shè)定物種為“Human”（人類），在設(shè)置中設(shè)定 “High confidence”為0.7，其余設(shè)定不變，獲取THYD治療KOA潛在靶標(biāo)的相互作用關(guān)系圖后導(dǎo)出，并且把關(guān)系圖的TSV格式文件導(dǎo)出。運(yùn)用R語言軟件（Rx64 3.6.0）統(tǒng)計出每個基因鄰接節(jié)點(diǎn)的個數(shù)并排序。并對鄰接節(jié)點(diǎn)個數(shù)位于前三十名進(jìn)行可視化。

1.6 基因本體（GO）分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）對預(yù)測出的THYD治療KOA的靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 THYD 活性成分

運(yùn)用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)OB和DL等參數(shù)初步篩選后獲得生物活性成分44個。其篩選的成分分布圖見圖1。

圖1 THYD 成分分布圖

2.2 KOA 的相關(guān)靶點(diǎn)

通過檢索GeneCard和OMIM數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行合并剔除重復(fù)靶點(diǎn)得到KOA相關(guān)的基因靶點(diǎn)共1499個。

2.3 THYD 成分—KOA 的共同靶標(biāo)基因

與THYD的102個潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行交集，最終得到THYD靶點(diǎn)與KOA靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)51個。見圖2。

圖 2 THYD—KOA 共靶 Venn 圖

2.4 THYD 成分-靶點(diǎn)-KOA 網(wǎng)絡(luò)圖

在上述研究基礎(chǔ)上構(gòu)建THYD活性成分-靶點(diǎn)-KOA網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖3。圖中共涉及節(jié)點(diǎn)102個，邊204個，圓形節(jié)點(diǎn)代表藥對于疾病的共同作用靶基因，V型節(jié)點(diǎn)代表THYD的活性成分，菱形代表疾病KOA，三角形代表THYD。在活性成分-靶點(diǎn)-KOA網(wǎng)絡(luò)圖中，所有交集靶點(diǎn)都至少與兩個以上的活性成分相連接，其中 IL—6（degree=40）、ALB（degree=39）、VEGFA（degree=38）、MAPK8（degree=36）、PPARG（degree=27）、RELA（degree=27）與活性成分連接度較高。所有活性成分都至少與2個以上作用靶點(diǎn)相連接，其中槲皮素（degree=43）、木犀草素（degree=20）、山奈酚（degree=19）、黃芩素（degree=14）以及 β—胡蘿卜素（degree=11）的連接度較高，可能是THYD防治KOA的中重要活性成分。THYD中一個活性成分可對應(yīng)多個靶標(biāo)，一個靶標(biāo)也可與不同的活性成分相對應(yīng)；可見THYD防治KOA具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖3 THYD 成分-靶點(diǎn)-KOA 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果見圖4，PPI網(wǎng)絡(luò)共包含51個節(jié)點(diǎn)，190條邊，平均Degree為7.45，其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，每條邊都表示靶點(diǎn)蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，邊的粗細(xì)代表相互作用力強(qiáng)弱。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)指標(biāo)Degree數(shù)值大小篩選出Degree排名前5位的靶點(diǎn)分別為：MAPK8（degree=24），VEGFA（degree=22），CASP3（degree=20），ESR1（degree=19），IL6（degree=19）。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖

2.6 THYD 治療 KOA 的 GO 分析（修改）

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對51個與治療KOA相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，選取P＜0.001的結(jié)果，并按富集靶點(diǎn)數(shù)進(jìn)行排序后進(jìn)行可視化。富集靶點(diǎn)數(shù)越多，THYD越有可能通過調(diào)節(jié)該生物學(xué)過程來治療KOA，由圖5、圖6可知，THYD治療KOA的相關(guān)生物學(xué)過程共有59個條目，THYD防治KOA可能跟酮反應(yīng)、細(xì)胞成熟、對紫外線的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡、腺體形態(tài)發(fā)生、女性性分化、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)控、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的調(diào)控、細(xì)胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)這些生物過程有關(guān)。

2.7 THYD 治療 KOA 的 KEGG 分析

通過 DAVID 數(shù)據(jù)庫對THYD治療KOA涉及的34個蛋白靶點(diǎn)在信號通路中的作用進(jìn)行研究,根據(jù)P＜0.001得到相關(guān)通路，共富集38條通路,同時構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。根據(jù)相關(guān)度排序，前5的通路分別是：NF-κB 信號通路，腫瘤通路，流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路，腫瘤壞死因子通路以及糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路。由圖7、圖8可見，THYD治療KOA是通過不同通路間相互傳遞信號進(jìn)行調(diào)節(jié)。

圖5 GO 富集分析條形圖

圖6 GO 富集分析網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 THYD 治療 KOA 信號通路富集分析網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 THYD 治療 KOA 信號通路富集分析網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

3.1 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對KOA 的研究

目前對于KOA的病因探究尚未完全明了[1]，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[20—22]，年齡是其最強(qiáng)風(fēng)險因素，年齡增大意味著再生能力的下降以及風(fēng)險因素的積累。此外，雌激素、骨密度、膝關(guān)節(jié)損傷、肥胖、遺傳等都是罹患OA的風(fēng)險因素。由于發(fā)病機(jī)制不完全明確，口服藥物具有一定的副作用，臨床上對于OA的防治尚無理想的療法[2]。

3.2 祖國醫(yī)學(xué)對KOA 的研究

KOA在在古代中醫(yī)學(xué)中并無具體病名，一般將本病歸入“痹證”“骨痹”范疇。對于膝痹的病因病機(jī)，歷代醫(yī)家總結(jié)認(rèn)為是以肝腎虧虛為本，風(fēng)寒濕邪外侵為標(biāo)：肝主筋，肝虧導(dǎo)致筋脈松弛，腎主骨，腎虛則骨質(zhì)松軟滋生贅物，加上活動時不慎扭傷關(guān)節(jié)或者贅物與筋肉摩擦產(chǎn)生瘀血，又遭受風(fēng)寒濕熱邪氣的入侵，諸因阻礙關(guān)節(jié)屈伸，發(fā)為痹痛?！额愖C治裁·痹證》說：“痹久必有瘀血”。而清代王清任亦于《醫(yī)林改錯· 卷下》中明確提出了“瘀血致痹”的病理機(jī)制。有現(xiàn)代研究受中醫(yī)“血瘀”理論啟發(fā)，通過結(jié)扎動物臀下靜脈、股靜脈及大隱靜脈8周后，成功造出早中期膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎動物模型[23]。綜上可知，瘀血與KOA的病因有密切的聯(lián)系?！侗静萁?jīng)疏》云，“桃仁，性善破血?！薄侗静輩R言》曰，“紅花，破血、行血、和血、調(diào)血之藥也?！碧胰?、紅花作為活血化瘀的經(jīng)典藥對，在現(xiàn)代治療KOA中亦多有運(yùn)用[14—15]。也有現(xiàn)代藥理研究文獻(xiàn)報道，桃仁可以改善血流動力學(xué)、抗炎鎮(zhèn)痛以及抗敏、抗腫瘤[24]；而紅花具有抗炎、抗血栓形成的作用[25]。上述文獻(xiàn)對于THYD治療KOA的機(jī)制都有借鑒意義。然而目前的藥理研究尚缺乏對THYD治療KOA的機(jī)制系統(tǒng)、全面的闡釋。

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能闡釋THYD 治療KOA 可能的作用機(jī)制

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，其整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥學(xué)的基本特點(diǎn)相吻合，是一門從系統(tǒng)層面揭示中藥對機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用的新興學(xué)科，為研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學(xué)之間的相互關(guān)系搭建了橋梁[26]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)地從分子水平層面上發(fā)現(xiàn)THYD治療KOA潛在的化學(xué)成分以及闡釋可能的作用機(jī)制。

通過上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可知，THYD主要化學(xué)成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、黃芩素以及β—胡蘿卜素等。其中有研究發(fā)現(xiàn)[27]，黃芩苷可通過對實驗用的骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型的肌肉氧化應(yīng)激進(jìn)行抑制，以減輕關(guān)節(jié)疼痛。本研究通過初步篩選獲得THYD中生物活性成分44個，并在此基礎(chǔ)上利用最終得到的22個生物活性成分，挖掘出102個可能的靶點(diǎn)和 204 個相互關(guān)系。根據(jù)藥效成分—靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)圖分析顯示，β—胡蘿卜素、木酚素、木犀草素、槲皮素等有效成分能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個靶點(diǎn)，白細(xì)胞介素6（IL6）、雌激素受體 α（ESR1）、雄激素受體（AR）等靶點(diǎn)也能與多個成分形成作用關(guān)系。THYD的藥效成分之間聯(lián)系緊密，而且其作用的靶點(diǎn)也在KOA的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著很大程度的作用。

對GO富集結(jié)果進(jìn)行討論：在富集靶點(diǎn)數(shù)排名前5的生物學(xué)過程中分別是：酮反應(yīng)、細(xì)胞成熟、對紫外線的反應(yīng)、對雌二醇的反應(yīng)、氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡。張恩尉[28]等通過實驗證實了雌二醇可通過與雌激素受體β 結(jié)合抑制骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的 NF-κB通路從而發(fā)揮抗炎作用；目前有研究表明[29]，氧化應(yīng)激過程在骨性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著重要的作用，氧化應(yīng)激過程中能產(chǎn)生大量的損傷關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)、導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)改變的自由基及炎癥因子。其余生物學(xué)過程尚未有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其與骨性關(guān)節(jié)炎的聯(lián)系，這從側(cè)面反應(yīng)出THYD治療KOA的生物過程極為復(fù)雜。

對KEGG通路富集結(jié)果進(jìn)行討論：THYD主要通過調(diào)節(jié)腫瘤、細(xì)胞凋亡、炎癥、糖尿病相關(guān)等38條信號通路而發(fā)揮治療KOA的作用。本研究決定對相關(guān)程度前5名的通路展開探討。NF—kappa B信號通路：有研究表明，NF-κB 信號通路在軟骨細(xì)胞的促炎應(yīng)激反應(yīng)中的眾多通路中處于核心位置[30]，其中，促炎細(xì)胞因子、趨化因子、應(yīng)激因子和細(xì)胞外基質(zhì)的降解產(chǎn)物可激活NF-κB 蛋白，在刺激之下，NF-κB 分子被進(jìn)一步激活，誘導(dǎo)一系列造成關(guān)節(jié)軟骨破壞的基因表達(dá)，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展[31]；腫瘤通路：目前尚無文獻(xiàn)報道該通路與KOA的相關(guān)性；利用Rndsystems網(wǎng)站（https://www.rndsystems.com/cn）查詢“cancer pathways”以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[32]可知低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路與腫瘤通路關(guān)聯(lián)性高且處于本研究KEGG通路圖中第9位。有相關(guān)研究[33]證實，增加 HIF-1α 的活性能夠誘導(dǎo)熱休克蛋白70（HSP70）的過度表達(dá)并增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)水平，從而防止軟骨細(xì)胞的凋亡；流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路：有文獻(xiàn)[34]表明動脈粥樣硬化跟骨性關(guān)節(jié)炎有一定的聯(lián)系，但尚無確切的實驗證據(jù)證實兩者聯(lián)系的密切性。目前尚無研究支持該通路與骨性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性；腫瘤壞死因子通路：有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α 通過抑制軟骨基質(zhì)合成、誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生，在膝骨關(guān)節(jié)炎的軟骨破壞中發(fā)揮重要作用[35-36]；糖尿病并發(fā)癥的AGERAGE信號通路：有相關(guān)研究報道并證實，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）可以與軟骨細(xì)胞膜上RAGE結(jié)合，對一系列細(xì)胞內(nèi)的信號通路進(jìn)行激活，進(jìn)而導(dǎo)致白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子α、基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá)增加，這是晚期糖基化終末產(chǎn)物導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎病變的主要途徑[37]。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)以及進(jìn)行GO和KEGG分析,發(fā)現(xiàn)桃仁-紅花藥對中的活性成分可能是通過調(diào)控體內(nèi)雌激素抑制滑膜細(xì)胞進(jìn)行抗炎；通過抑制軟骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)對膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行保護(hù)；通過NF-κB信號通路、腫瘤壞死因子通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路，分別對NF-kB因子、白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子α 、基質(zhì)金屬蛋白酶13等炎性因子的表達(dá)進(jìn)行抑制從而抑制炎癥反應(yīng)以及減少對軟骨的破壞。充分說明桃仁-紅花藥對治療膝骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制具有多成分-多靶點(diǎn)-多層次-多通路的特點(diǎn)。

5 展望

經(jīng)以上網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的探索可知，桃仁-紅花作為活血化瘀的經(jīng)典藥對，在治療“痹證”的作用機(jī)理具有一定的藥理依據(jù)。有相關(guān)研究表明[38]，瘀血跟炎癥具有密切的關(guān)系，血清白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等炎性因子都參與了血瘀證的形成。而THYD對IL—6通路、TNF通路都具有調(diào)節(jié)作用?？梢酝ㄟ^藥理學(xué)實驗進(jìn)一步探究THYD或者在中醫(yī)角度上以活血化瘀為主的復(fù)方對KOA的消炎作用。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)二仙湯加味對去卵巢大鼠的血清雌二醇（E2）有提升作用[39],而雌二醇可通過與雌激素受體β 結(jié)合以抑制骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的 NF-κB 通路從而發(fā)揮抗炎作用[28]，由網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的生物學(xué)過程分析可知THYD有通過調(diào)節(jié)雌二醇治療KOA的可能。這為藥理實驗進(jìn)一步探究THYD的調(diào)節(jié)雌二醇的可能性以及臨床上二仙湯的組方都提供了研究方向與思路。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，老年膝骨關(guān)節(jié)炎最常見為肝腎虧虛型。有研究認(rèn)為，隨著年齡的增加，體內(nèi)會有大量晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生和堆積，而晚期糖基化終末產(chǎn)物是骨關(guān)節(jié)炎年齡致病因素的分子學(xué)基礎(chǔ)[40]。由本研究的KEGG通路富集分析可知，THYD可能通過調(diào)節(jié)AGE-RAGE信號通路對KOA產(chǎn)生治療作用。因此進(jìn)一步探究肝腎虧虛證型與晚期糖基化終末產(chǎn)物的聯(lián)系以及通過藥理學(xué)實驗探究THYD對晚期糖基化終末產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用也有一定的意義。

本研究期望能為今后的關(guān)于本藥對的藥理實驗提供一定的文獻(xiàn)基礎(chǔ)及重要的理論依據(jù)，同時為今后中醫(yī)臨床上的組方以及藥理實驗提供更多有意義的方向與思路。