高 飛， 張 明， 夏仁江， 韓利濤

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 物理學(xué)教研室， 貴州 遵義 563003； 2.鄭州大學(xué) 河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450001)

20世紀(jì)80年代末期，中國(guó)科學(xué)院離子束生物工程學(xué)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)離子注入生物學(xué)效應(yīng)，為離子束生物工程技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物的改良揭開了序幕[1]。離子束生物工程技術(shù)的作用機(jī)理是將一定劑量離子注入植物細(xì)胞壁(農(nóng)作物一般是胚)，通過(guò)粒子的植入、能量的輸入、動(dòng)能的傳遞以及電荷的交換，從而誘導(dǎo)植物發(fā)生可遺傳變異[2]。目前，離子束注入技術(shù)不僅可應(yīng)用于農(nóng)作物品種的改良，而且在微生物細(xì)胞的刻蝕以及轉(zhuǎn)基因上也得到廣泛應(yīng)用[3]。李興林等[4]用低能重離子輻照春麥定西24，經(jīng)過(guò)多年篩選獲得2個(gè)穩(wěn)定的后代118和119，經(jīng)測(cè)定118的蛋白質(zhì)含量較春麥定西24提高1百分點(diǎn)，輻照后代的高分子量麥谷蛋白亞基類型相對(duì)含量發(fā)生較大變化。張利華[5]以粉質(zhì)小麥輻36為材料，經(jīng)氮離子注入后，M2代出現(xiàn)高稈植株占72.6%。甘斌杰等[6]對(duì)小麥8553進(jìn)行離子束注入發(fā)現(xiàn)，后代發(fā)生了種皮由白變紅的誘變。離子束注入的劑量不同、不同作物或同一作物不同品種所產(chǎn)生的誘變效果各不相同[7-9]。

小麥?zhǔn)琴F州的主要糧食作物之一，其種植面積和產(chǎn)量?jī)H次于水稻和玉米[10]。但是由于受自然環(huán)境或耕作水平影響，貴州小麥的品質(zhì)不能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或企業(yè)收購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)，因而小麥價(jià)格不高，許多小麥加工企業(yè)基本從外省購(gòu)進(jìn)專用優(yōu)質(zhì)小麥，使貴州各地區(qū)小麥種植嚴(yán)重受到地域性限制[11]。鑒于此，研究采用離子束生物技術(shù)，通過(guò)適宜劑量的氮離子注入小麥種子，分析注入氮離子束對(duì)小麥種子活力、幼苗POD和CAT活性以及植株農(nóng)藝形狀的影響，探究氮離子束對(duì)小麥種子的誘變效應(yīng)，以期為促進(jìn)優(yōu)質(zhì)高效小麥育種技術(shù)體系的建設(shè)與貴州小麥的種質(zhì)創(chuàng)新及優(yōu)良品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種分別為榮春南麥1號(hào)和吉麥1號(hào)。榮春南麥1號(hào)為南充市農(nóng)業(yè)科學(xué)院與四川榮春種業(yè)有限責(zé)任公司共同選育，貴州引進(jìn)種植；吉麥1號(hào)為貴州吉豐種業(yè)有限責(zé)任公司選育。小麥種子均由遵義醫(yī)科大學(xué)物理學(xué)教研室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用低能(30～200 keV)氮離子束注入技術(shù)，向小麥種子注入氮離子束進(jìn)行試驗(yàn)。以未注入氮離子束的小麥種子為空白對(duì)照，以注入氮離子束(劑量為3×1017N+/cm2)的種子為處理對(duì)象。為便于試驗(yàn)比較，將供試小麥品種榮春南麥1號(hào)編號(hào)為GG11，吉麥1號(hào)編號(hào)為GG12；GG11注入氮離子束后編號(hào)為SG11，GG12注入氮離子束后編號(hào)為SG12，共4個(gè)處理?？疾熳⑷氲x子束后小麥種子的活力和幼苗的POD與CAT活性，以及田間小麥的植株形態(tài)變化。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥種子注入氮離子束 2016年10月在鄭州大學(xué)離子束實(shí)驗(yàn)室采用TITAN脈沖式離子注入機(jī)向小麥GG11和GG12的新鮮、飽滿、無(wú)破損籽粒注入氮離子，注入?yún)?shù)為氮離子能量30 keV，脈沖頻率25 Hz，脈沖寬度40 μs，束流2 mA，劑量3×1017N+/cm2。

1.3.2 小麥種子活力測(cè)定 將對(duì)照材料GG11和GG12與注入氮離子的材料SG11和SG12各取100粒種子，每個(gè)培養(yǎng)皿中(底部墊有潮濕的濾紙)置入25粒。于25℃恒溫箱催芽，記錄每天發(fā)芽數(shù)。培養(yǎng)第3天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，培養(yǎng)第10天隨機(jī)測(cè)量10株幼苗鮮重和苗長(zhǎng)，取平均值。

發(fā)芽勢(shì)=前3 d供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽率=前7 d供試種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

出苗率=前10 d供試種子出苗籽粒數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

1.3.3 小麥幼苗POD及CAT活性測(cè)定 小麥種子恒溫箱培養(yǎng)第10天即小麥幼苗長(zhǎng)至2葉期時(shí)進(jìn)行首次酶活性測(cè)定，之后第5天起每隔1 d測(cè)1次，連續(xù)測(cè)定5次。POD及CAT活性測(cè)定分別采用愈創(chuàng)木酚氧化法和酶促反應(yīng)法進(jìn)行[12]。

1.3.4 小麥植株農(nóng)藝性狀比較 2016 年 10月15 日將GG11、SG11、GG12和SG12小麥種子播于貴州省桐梓縣燎原鎮(zhèn)大關(guān)村實(shí)驗(yàn)基地，播種行距 20 cm，株距 18 cm，每個(gè)材料播2行(行長(zhǎng)約10 m)。小麥成熟后，每行取10 株植株，測(cè)量頂一葉長(zhǎng)度、植株株高及主莖穗長(zhǎng)，考察小麥穗粒數(shù)、千粒重和穗芒情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)基本運(yùn)算，SPSS 22進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin Pro 8制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能氮離子束注入對(duì)小麥種子活力的影響

從表1看出，種子發(fā)芽勢(shì)SG11顯著低于其空白對(duì)照GG11，SG12極顯著低于其空白對(duì)照GG12；出苗率SG11低于GG11，SG12顯著低于GG12；發(fā)芽率SG11和SG12均低于相應(yīng)對(duì)照GG11和GG12。說(shuō)明，小麥種子注入低能氮離子束后其種子萌發(fā)受到抑制，種子活力下降。

表1小麥種子注入低能氮離子束后種子的萌發(fā)情況

Table 1 Germination situation of wheat seeds injected with low energy N+ion beam %

處理Treatment發(fā)芽勢(shì) Germination vigor發(fā)芽率Germination rate出苗率 Emergence rateGG1176±3.293±1.591±3.5SG1167±2.5?87±4.585±4.5GG1277±3.490±3.588±5.5SG12 58±5.4 ??83±5.780±6.4?

注：*、**分別表示與相應(yīng)對(duì)照差異達(dá)顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)，下同。

Note: * and** indicate significance of difference atP<0.05 andP<0.01 level respeceively.The same below.

2.2 低能氮離子束注入對(duì)小麥幼苗素質(zhì)的影響

從圖1看出，小麥幼苗鮮重和苗高形態(tài)指標(biāo)對(duì)低能氮離子束注入的反應(yīng)較為強(qiáng)烈，注入低能氮離子束后小麥苗高與鮮重都略有降低，其中SG11苗高降低明顯。表明，低能氮離子束注入小麥后，其生理指標(biāo)發(fā)生一定的生物效應(yīng)。

Fig.1 Fresh seedling weight and height of wheat seeds injected with low energy N+ion beam

2.3 低能氮離子注入對(duì)小麥幼苗POD及CAT活性的影響

從圖2看出， 4個(gè)小麥材料幼苗的POD和CAT活性隨生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)。SG11和SG12幼苗POD和CAT活性在相同時(shí)段均高于其相應(yīng)的空白對(duì)照GG11和GG12。表明，小麥籽粒注入低能量氮離子束后其幼苗POD和CAT活性增大。

2.4 低能氮離子注入對(duì)小麥主要農(nóng)藝性狀的影響

從表2看出，與GG11相比，SG11的株高、穗長(zhǎng)度、穗粒數(shù)下降，其株高從92.3 cm降至71.1 cm，降低22.9%，差異極顯著；SG11頂葉長(zhǎng)和千粒重增加，頂葉長(zhǎng)從24.2 cm升至26.1 cm，升高7%；千粒重從54.6 g升至56.2 g，升高2.8%，但差異不顯著。

與GG12相比，SG12的頂葉長(zhǎng)、株高、穗長(zhǎng)及穗粒數(shù)下降，頂一葉長(zhǎng)從26.4 cm降至21.6 cm，降低18.2%，差異顯著；株高從86.6 cm降至78.6 cm，降低9.2%，差異顯著；穗粒數(shù)從34粒降至29粒，降低14.7%，差異顯著。千粒重從46.4 g升至48.5 g，升高4.3%，但差異不顯著。

總體看，小麥籽粒注入氮離子束后其株高、穗長(zhǎng)和穗粒數(shù)顯著低于未注入氮離子束的處理，說(shuō)明小麥籽粒注入氮離子束明顯抑制植株生長(zhǎng)，但可促進(jìn)千粒重增加。另外，注入氮離子束的小麥有部分麥芒產(chǎn)生突變，出現(xiàn)缺芒或無(wú)芒現(xiàn)象。

表2 低能氮離子束注入小麥的主要農(nóng)藝性狀

3 結(jié)論與討論

研究表明，低能氮離子束(劑量為3×1017N+/cm2)注入對(duì)小麥種子萌發(fā)有抑制效應(yīng)，小麥注入氮離子束后，種子活力下降，其發(fā)芽率和出苗率顯著低于未注入氮離子束的處理。低能氮離子束注入也抑制小麥幼苗生長(zhǎng)，顯著降低幼苗的鮮重和苗長(zhǎng)，可能是因?yàn)殡x子束能量沉積和傳遞效應(yīng)綜合作用使小麥種子萌發(fā)期間胚根及后期主根生長(zhǎng)發(fā)育不良而導(dǎo)致。而小麥種子注入低能量氮離子束后其幼苗POD和CAT活性增大。低能氮離子束注入后引起小麥第1代農(nóng)藝性狀發(fā)生廣泛的遺傳變異，研究發(fā)現(xiàn)，注入低能氮離子束后植株出現(xiàn)頂一葉突變、株高降低、麥芒缺芒或無(wú)芒及千粒重增加等顯著的性狀變異。

低能氮離子束對(duì)小麥種子活力和植株形態(tài)均具有顯著的生物學(xué)效應(yīng)，主要表現(xiàn)在種子萌發(fā)受挫、幼苗POD和CAT活性增強(qiáng)、植株誘變效果明顯(植株變矮，麥穗上出現(xiàn)缺芒、無(wú)芒等現(xiàn)象)及千粒重增大等。此效應(yīng)均來(lái)自于注入低能氮離子束的小麥當(dāng)代，某些性狀是否在第2代中得以延續(xù)，尚需進(jìn)一步跟蹤研究，若后代出現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)良性狀，則可用于小麥種質(zhì)材料的改良。