李瓊 徐斌 王權(quán)

[摘要] 目的 建立靈芝調(diào)脂茶的質(zhì)量控制方法。 方法 采用薄層色譜法（TLC）鑒別靈芝;高效液相色譜法測(cè)定綠原酸的含量。 結(jié)果 靈芝的TLC鑒別特征性明顯、專(zhuān)屬性強(qiáng);綠原酸在25.40～253.97 μg/mL（r2 = 0.9991）線(xiàn)性關(guān)系良好，平均回收率為100.14%，RSD為1.6%。 結(jié)論 本研究方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果良好，能有效控制藥品的質(zhì)量，為制定靈芝調(diào)脂茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 靈芝調(diào)脂茶;靈芝;綠原酸;薄層色譜法;高效液相色譜法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）03（c）-0111-03

[Abstract] Objective To establish the quality standard for Linzhitiaozhi Tea. Methods Thin layer chromatography （TLC）? was adopted in the qualitative identification of Ganoderma. High performance liquid chromatography was used for the content determination of chlorogenic acid. Results The spots of TLC were distinctive without negative interference. The response of chlorogenic acid was linear in the range of 25.40-253.97 μg/mL （r2 = 0.9991）， the average recoverie was 100.14%， RSD was 1.6%. Conclusion This reasonable and feasible method can be used for the quality control of Linzhitiaozhi Tea.

[Key words] Linzhitiaozhi Tea; Ganoderma; Chlorogenic acid; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography

靈芝調(diào)脂茶是安微省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有活血化瘀、補(bǔ)氣生血、改善記憶功能的功效，主要用來(lái)治療冠心病、腦血管等心腦血管系統(tǒng)疾病[1]。臨床長(zhǎng)期應(yīng)用以來(lái)，效果確切，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立于2005年，時(shí)間久，要求比較低，僅做一些常規(guī)檢驗(yàn)，并沒(méi)有系統(tǒng)性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究與建立，難以有效的控制藥品的質(zhì)量。本方中靈芝主要含有多糖、三萜類(lèi)、核苷等化合物[2-4]，具有抗衰老、抗阿爾茨海默癥、抗氧化及防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用[5-9];菊花、羅布麻、茉莉花均含有一定量的綠原酸[10-12]，綠原酸對(duì)于降壓降脂、保護(hù)心血管和抗肝纖維化等有良好治療作用[13-17]。針對(duì)以上，本研究以靈芝藥材和綠原酸為主要控制指標(biāo)，通過(guò)定性定量的方法，為其建立穩(wěn)定有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

xp-20百萬(wàn)分之一電子分析天平（梅特勒-上海托利多）;GoodSee-20E薄層色譜成像系統(tǒng)（上海科哲生化科技有限公司）;Waters e2695-2489 高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司），2489紫外檢測(cè)器，2695四元泵，2695脫氣機(jī)及2695自動(dòng)進(jìn)樣器;ZRS-8G智能溶出儀（天津天光光學(xué)儀器有限公司）。

靈芝調(diào)脂茶（批號(hào)：180503、190110、190205、190305，自制，每袋重3 g）;綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201415，純度為93.4%），靈芝對(duì)照藥材（批號(hào)：120968-201408）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;乙腈、磷酸均為色譜純;其他試劑均為分析純;水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 靈芝的薄層色譜鑒別

參考《中華人民共和國(guó)藥典》[18]方法，取3批靈芝調(diào)脂茶內(nèi)容物各約2 g，置于錐形瓶中，加95%的乙醇40 mL振搖混勻后超聲提取，超聲30 min后，取出，冷卻至室溫，濾過(guò)，取續(xù)濾液，水浴上蒸干，將剩余的物質(zhì)加入1 mL甲醇使溶解，作為供試品溶液;取靈芝對(duì)照藥材1 g，加95%的乙醇40 mL超聲提取，選用功率250 kW，頻率40 kHz，超聲30 min后，取出，冷卻至室溫，濾過(guò)，取續(xù)濾液，蒸干后加1 mL甲醇使溶解，作為相應(yīng)的對(duì)照藥材溶液;取缺靈芝藥材的缼味制劑2 g，按上述方法，制成陰性對(duì)照溶液。吸取對(duì)照藥材溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各3 μL，依次按序點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（8∶1）的混合溶液為展開(kāi)劑，置展開(kāi)槽中展開(kāi)，待前沿距離板上緣1 cm取出，晾干，置于紫外燈波長(zhǎng)365 nm下檢視。供試品溶液與對(duì)照溶液在相同位置上熒光斑點(diǎn)一致，陰性對(duì)照在同一位置上沒(méi)有斑點(diǎn)。此鑒別方法穩(wěn)定可行，專(zhuān)屬性強(qiáng)。見(jiàn)圖1。

1：靈芝對(duì)照藥材;2～4：3批供試品溶液;5：陰性對(duì)照溶液

2.2 綠原酸的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制? 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品13.59 mg，加50%的甲醇定容至25 mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的配制? 靈芝調(diào)脂茶的內(nèi)容物過(guò)3號(hào)篩，取約1 g，精密稱(chēng)定，置于250 mL錐形瓶中，精密量取50 mL的50%甲醇，加入，密塞，稱(chēng)定重量，超聲提?。?50 kW，40 kHz）30 min，取出，靜置冷卻至室溫，稱(chēng)定重量，減失的重量用50%的甲醇補(bǔ)足后混勻，濾紙過(guò)濾，吸取濾液，用針式過(guò)濾過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的配制? 取按本品處方比例的缺菊花、羅布麻、茉莉花的陰性樣品，按照處方工藝制備成缼味制劑，再根據(jù)“2.2.2”項(xiàng)方法操作，制備成陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 色譜條件? 色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）等度洗脫（90∶10），流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm[18-20]。進(jìn)樣量10 μL。

2.2.5 專(zhuān)屬性考察? 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，按照“2.2.4”項(xiàng)，注入色譜儀中，測(cè)定，每次進(jìn)樣10 μL。樣品中的其他成分對(duì)于綠原酸的測(cè)定無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

2.2.6 精密度的考察? 取濃度為25.4 μg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)6次進(jìn)樣，記錄綠原酸的峰面積353 478、 355 320、3 557 795、354 822、355 546、366 114，RSD = 1.3%，<2.0%，儀器的精密度良好。

2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)? 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于量瓶中，加50%的甲醇溶液稀釋至10 mL，振搖混勻，依照“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到綠原酸的回歸方程為Y = 12 821X+76 702（r2 = 0.99 91），即綠原酸在25.40～253.97 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.8 穩(wěn)定性的考察? 取同一批樣品（180503）按“2.2.2”項(xiàng)下現(xiàn)制成供試品溶液，在制備后于0、2、4、8、16、24 h按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸的峰面積612 726、622 544、623 708、624 255、617 504、620 678，綠原酸在24 h內(nèi)峰面積的RSD為0.7%（n = 6），供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性的考察? 取同一批號(hào)的樣品（180503），精密稱(chēng)定1 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)平行制備成供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算得知綠原酸的含量為2.037、2.037、2.070、2.054、2.038、2.040 mg/g，平均含量為2.046 mg/g，RSD = 0.7%，即該方法的重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗(yàn)? 稱(chēng)取已知含量的供試品1 g，精密稱(chēng)定，共計(jì)6份，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)供試品溶液方法制備，進(jìn)樣10 μL，注入色譜中進(jìn)行檢測(cè)分析。見(jiàn)表1。

2.2.11 3批樣品的含量測(cè)定? 精密稱(chēng)取3批樣品（批號(hào)：190110、190205、190305）各約1 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制成供試品，依“2.2.4”測(cè)定綠原酸含量。見(jiàn)表2。

3 討論

薄層色譜鑒別中超聲提取和回流提取兩種方式，均能有效提取，因考慮操作便利性，選擇超聲提取方式;展開(kāi)劑的選擇中，考察了正己烷-乙酸乙酯（8∶1）和石油醚-乙酸乙酯（8∶1），石油醚-乙酸乙酯（8∶1）系統(tǒng)中樣品的主斑點(diǎn)更清晰，識(shí)別度高，因此選用其作為展開(kāi)劑。含量測(cè)定中供試品的提取溶劑選用50%甲醇和稀乙醇進(jìn)行對(duì)比考察，發(fā)現(xiàn)50%的甲醇提取效率要高于稀乙醇，且雜質(zhì)少，峰型良好，因此選用50%甲醇。通過(guò)薄層色譜鑒別靈芝，方法簡(jiǎn)便、可靠、專(zhuān)屬性強(qiáng)，高效液相色譜方法穩(wěn)定、可控、專(zhuān)屬性好為靈芝調(diào)脂茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供切實(shí)的依據(jù)，可更好地控制靈芝調(diào)脂茶的質(zhì)量，以保障藥品的均一性、穩(wěn)定性和有效性。

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（收稿日期：2019-08-27? 本文編輯：劉永巧）