徐兵，李蕾，陳貴元

(1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理；2.重慶市涪陵中心醫(yī)院，重慶；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理；4.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理）

0 引言

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）是嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，由RB1 基因的突變引起[1]。其發(fā)病率約1：20000，大多數(shù)患兒發(fā)病年齡小于5 歲[2-3]。由于RB 具有潛在致盲性甚至危及生命，因此可給家庭及社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[4-5]?，斂ǎㄎ靼嘌勒Z：Maca，學(xué)名：LepidiummeyeniiWalp），是一種十字花科植物，主產(chǎn)于秘魯東南部安第斯山脈，我國主要分布于云南迪慶、麗江等高寒山區(qū)[6-7]。其有改善性功能、提高生育能力、抗疲勞以及治療更年期綜合癥等作用。多糖普遍存在于生物體內(nèi)，具有抗腫瘤、抗菌、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等多種作用[8-9]。本文旨在研究瑪卡多糖對體外培養(yǎng)的Y79 細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究瑪卡多糖的抗腫瘤作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

瑪卡多糖的提取參考李月、陳貴元等[10]的研究方法進(jìn)行提取；Y79 細(xì)胞株（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；RPMI 1640 培養(yǎng)基及胎牛血清（美國Thermo scientific 公司）；增強(qiáng)型CCK8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；細(xì)胞周期檢測試劑盒（四正柏生物）；Trzol（Vazyme Biotech Co.，Ltd）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme Biotech Co.，Ltd）；ChamQTM SYBR? qPCR Master MiX（Vazyme Biotech Co.，Ltd），PCR 引物（金斯瑞生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

Y79 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。瑪卡多糖溶解于RPMI 1640 培養(yǎng)基，過濾除菌后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測

Y79 細(xì)胞被制成1×105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，接種于96 孔板上，每孔為100μl；對照組加入RPMI 1640 完全培養(yǎng)基100μl，實(shí)驗(yàn)組加入溶有瑪卡多糖的完全培養(yǎng)基100μl，終濃度分別為0.5、1、2、4mg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入增強(qiáng)型CCK8 試劑20μl，再于培養(yǎng)箱中孵育4 小時(shí)后以酶標(biāo)儀在450nm 波長下檢測各孔吸光光度值（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)胞存活率=[實(shí)驗(yàn)組吸光光度值-空白組吸光光度值/對照組吸光光度值-空白組吸光光度值]×100%。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測

收集Y79 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組以終濃度為1mg/mL 瑪卡多糖干預(yù)細(xì)胞，對照組加入等體積完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 小時(shí)后，取1X106 個(gè)細(xì)胞以預(yù)冷的PBS 洗滌兩次后以75%乙醇4℃固定過夜，離心后加入100μl RNaseA，37℃水浴30min，加入400μl PI，4℃避光孵育30min 后上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 熒光定量PCR 檢測CDK1、CyclinB1 的表達(dá)

收集實(shí)驗(yàn)組（瑪卡多糖終濃度1mg/mL）和對照組（加入等體積完全培養(yǎng)基），培養(yǎng)48 小時(shí)后的Y79 細(xì)胞，以Trzol 試劑提取總RNA 后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用ChamQTM SYBR? qPCR Master MiX 進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin 為內(nèi)參，引物見表1，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min、95℃變性15s、55℃退火15s，72℃延伸60s，循環(huán)40 次后分析各樣本Ct 值，然后采用2-ΔΔCt 計(jì)算基因的相對表達(dá)量。以上步驟均按試劑說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 瑪卡多糖對Y79 細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的瑪卡多糖處理Y79 細(xì)胞不同時(shí)間后，實(shí)驗(yàn)組各組的細(xì)胞存活率均低于對照組，且隨時(shí)間及瑪卡多糖濃度的增加生存率逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或0.01）。表明，瑪卡多糖可抑制Y79 細(xì)胞增殖。詳見圖1、表2。

2.2 瑪卡多糖對Y79 細(xì)胞周期的影響

由圖2 可知，1.0mg/mL 瑪卡多糖Y79 細(xì)胞干預(yù)48h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，實(shí)驗(yàn)組Y79 細(xì)胞G2/M 期分布比例明顯增高（P＜0.01）。詳見圖2、表3。表明，瑪卡多糖可促使Y79 細(xì)胞周期停滯于G2/M 期。

圖1 瑪卡多糖對Y79 細(xì)胞增殖能力的影響

表2 瑪卡多糖在不同濃度和時(shí)間點(diǎn)Y79 細(xì)胞的存活率（n=3，

表2 瑪卡多糖在不同濃度和時(shí)間點(diǎn)Y79 細(xì)胞的存活率（n=3，

注：與對照組相比，*P＜0.01，# P＜0.05。

組別（mg/mL） 細(xì)胞生存率（%）24h 48h 72h 0.0 94.39±1.57 95.39±1.45 94.37±1.70 0.5 86.81±1.57# 55.71±2.30* 44.70±1.49*1.0 60.46±3.08* 32.08±1.58* 16.67±2.27*2.0 40.42±0.85* 21.23±1.88* 11.13±1.46*4.0 30.38±1.26* 14.50±1.25* 7.46±0.89*F 值 701.776 1080.155 1499.379 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測Y79 細(xì)胞的周期分布

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Y79 細(xì)胞周期的分布（n=3，

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Y79 細(xì)胞周期的分布（n=3，

注：與對照組相比，* P＜0.01

分組 G0/G1（%） S（%） G2/M（%）陰性組 53.39±2.58 42.43±2.88 2.02±0.28 *瑪卡多糖組 41.05±2.30 46.96±3.68 9.61±1.25 *

2.3 瑪卡多糖對Y79 細(xì)胞CDK1、CyclinB1 mRNA 表達(dá)的影響

熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，1.0mg/mL 瑪卡多糖處理Y79 細(xì)胞48h 后，CDK1、CyclinB1 在mRNA 水平表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表明瑪卡多糖可抑制Y79 細(xì)胞CDK1、CyclinB1在mRNA 水平的表達(dá)。詳見圖3。

圖3 瑪卡多糖對Y79 細(xì)胞CDK1、CyclinB1 mRNA 表達(dá)的影響

3 討論

近年來，隨著個(gè)體化綜合治療以及眼底篩查等手段的開展，較多RB 患兒可獲得早期診斷及治療，這大大提高了患兒的生存率，但在很多欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，生存率仍較低[11,12]。目前化療仍是臨床上廣泛運(yùn)用的方法，而大多數(shù)諸如卡鉑等化療藥物可引起胃腸道不適、暫時(shí)性脊髓抑制和繼發(fā)性白血病等不良反應(yīng)[13]，同時(shí)出現(xiàn)的腫瘤耐藥性限制了其臨床應(yīng)用。由于RB 患兒大多數(shù)小于5 歲，這就要求化療藥物必須安全、有效?，斂ㄗ鳛槲覈膫鹘y(tǒng)中藥，長期運(yùn)用于臨床治療多種疾病，具有安全、廉價(jià)等特點(diǎn)。因此我們探索了瑪卡多糖的抗RB 活性及機(jī)制。

經(jīng)瑪卡多糖處理后，通過檢測Y79 細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，瑪卡多糖可抑制細(xì)胞增殖?，斂ǘ嗵菨舛扔傻偷礁?，細(xì)胞增殖抑制逐漸增加，而隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率亦逐漸增加。表現(xiàn)出明顯的濃度與時(shí)間依賴性。通過細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組Y79 細(xì)胞G2/M 期比例高于對照組。因此，我們推測，Y79 細(xì)胞存活率的下降可能與瑪卡多糖促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinB1 是Cyclin 家族的重要成員，通過與激酶CDK1 形成復(fù)合物后可引起下游的RB 蛋白磷酸化，RB 蛋白磷酸化后便失去了對轉(zhuǎn)錄因子E2F 的抑制活性，繼而E2F 恢復(fù)活性并加速細(xì)胞周期由G2 期進(jìn)入M 期[14,15]。

通過熒光定量PCR 檢測，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組Y79 細(xì)胞的CDK1和CyclinB1 在mRNA 的表達(dá)上明顯低于對照組，而CDK1 和CyclinB1 是細(xì)胞周期通路中調(diào)節(jié)G2/M 期的關(guān)鍵蛋白。因此，我們認(rèn)為瑪卡多糖可能通過下調(diào)CDK1、CyclinB1 的表達(dá)來促使Y79 細(xì)胞停滯在G2/M 期，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

總的來說，瑪卡多糖具有抗RB 活性，其可能的作用機(jī)制為通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。瑪卡多糖作為一種全新的藥物，有望成為治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的有效或輔助藥物。接下來我們將在動(dòng)物水平進(jìn)一步驗(yàn)證其抗RB 活性。